徐旺燁，樊 琛，喬薪瑗，唐麗杰，劉 敏，王 麗，徐義剛，姜艷平，崔 文，李一經(jīng)

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059）

·研究論文·

34株雞大腸桿菌的分離鑒定及致病力分析

徐旺燁1，樊 琛2，喬薪瑗1，唐麗杰1，劉 敏1，王 麗1，徐義剛1，姜艷平1，崔 文1，李一經(jīng)1

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059）

本研究從雞泄殖腔取樣，分離大腸桿菌菌株，進行生化鑒定。結(jié)果顯示34株菌株符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性。將分離得到的34株大腸桿菌與購買的4株雞大腸桿菌分別接種雞胚，對致病力進行分析。結(jié)果采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS分析90%置信區(qū)間，其中19株為致病力較強菌株（致死率大于上限38.4%），16株為致病力較弱或無致病力菌株（致死率小于下限25.1%），3株為中等致病力菌株（致死率在上限和下限之間）。通過套式PCR對38株菌的iss基因進行檢測，陽性率為100%。結(jié)果表明，iss基因（increased serum survival gene）在雞大腸桿菌中廣泛存在，38株雞大腸桿菌均有iss基因，但致病力大小不同，故推測致病力大小可能與iss基因的存在無關(guān)。

大腸桿菌；致病力；套式PCR；iss基因；分離；鑒定

禽大腸桿菌?。╝vian bacillosis）是由禽致病性大腸桿菌的某些血清型所引起的一類疾病的總稱［1］，病型多樣，其中急性敗血型危害最大［2］。大腸桿菌在自然環(huán)境中分布很廣，在雞舍的墊料、飼料、糞便及灰塵中廣泛存在，是雞腸道內(nèi)常在菌。大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是條件性致病菌，在正常情況下一般不會對機體造成影響，但在雞體質(zhì)下降，環(huán)境惡劣，應(yīng)激強烈，或者與其他致病菌混合感染時會造成發(fā)病。臨床癥狀主要為腹瀉，可造成卵黃囊炎、全眼球炎、心包炎、臍炎、敗血癥、肉芽腫、滑膜炎、輸卵管炎等，對養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失。iss基因（increased serum survival gene）是大腸桿菌的毒力基因之一［3］，其作用是增強大腸桿菌在血清中的生存能力［4，5］，從而增加其致病力。本研究從雞的泄殖腔中分離鑒定出34株大腸桿菌，并對其進行iss基因檢測和致病力的分析，以探求他們之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1試劑 三糖鐵瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司；伊紅美藍培養(yǎng)基購自青島日水生物技術(shù)有限公司；微量生化反應(yīng)管均購自杭州天和微生物試劑有限公司；過氧化氫溶液購自天津基準化學(xué)試劑公司；KOD-plus-NEO購自東洋紡生物科技有限公司；DL 2000 DNA marker 購自Takara公司。

1.2菌種 H L 1～3 4為分離的雞大腸桿菌，CVCC1553、CVCC1562、CVCC1568、CVCC1551購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3大腸桿菌的分離 將采集的泄殖腔拭子置于5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)6～8 h后，用該菌液于伊紅美藍固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)8～12 h，挑取深紫色帶有金屬光澤的單菌落于麥康凱固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，反復(fù)多次，進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察菌落形態(tài)。

1.4生化試驗 將初步分離到的可疑菌落進行吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、淀粉酶試驗、枸櫞酸鹽利用試驗，乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇發(fā)酵試驗，產(chǎn)硫化氫試驗、尿素酶試驗，觸酶試驗，運動性試驗，三糖鐵斜面穿刺試驗，觀察試驗結(jié)果。

1.5雞胚致死試驗 參考文獻［6］將待測大腸桿菌分別劃板，挑取平板上的單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)，然后離心，經(jīng)PBS洗2次，并用PBS懸浮，進行倍比稀釋。取0.1 mL稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚（購自聊城陽谷孵化廠），大約100～300 CFU/只，每組10只。同時取0.1 mL稀釋液涂板，做細菌計數(shù)。對照組分兩組，一組注射PBS，一組不注射。計每日死亡數(shù)，至d 4，計胚胎致死率。

1.6套式PCR 使用套式PCR，引物序列參考文獻［7］。上游引物1：5'-AGCTATCGTTTAATTATTATC AC-3'，下游引物1：5'-GTAGGGAGCCCA GAAGTAT-3'。上游引物2：5'CGCGGATCCAGGAT TCTGCCGTTTTTA-3'，下游引物2：5'-CGCGTCGA CCATATCGATGGGCAACTA-3'。PCR反應(yīng)體系：5×buffer 5μL、dNTP 4 μL、MgSO44 μL、上下游引物各1.5 μL、KOD-plus-NEO 0.5 μL、ddH2O 30.5 μL、模板3 μL。第一輪程序：97℃預(yù)變性5 min；94℃變性 1 min，47℃退火 1 min，68℃延伸0.5 min，9個循環(huán)；95℃變性 1 min，68℃ 0.5 min，25個循環(huán)；68℃終延伸10 min。第二輪程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 變性1 min，47℃退火 1 min，68℃延伸 0.5 min，28個循環(huán)；68℃終延伸10 min。

2　結(jié)果

2.1分離結(jié)果 分離的34株細菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈紫黑色并帶金屬光澤，在麥康凱培養(yǎng)基上呈桃紅色，符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性，鏡檢可以觀察到革蘭氏陰性、兩端鈍圓小桿菌，散在或成對出現(xiàn)，并無其他形態(tài)菌，可以初步鑒定為大腸桿菌的純培養(yǎng)物。

2.2生化試驗結(jié)果 將分離出的34株大腸桿菌分別命名為HL1～34。34株細菌三糖鐵斜面穿刺試驗均為上下一致黃色，瓊脂分層，產(chǎn)氣。生化試驗中34株菌均能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，26株發(fā)酵蔗糖，31株發(fā)酵木糖，33株發(fā)酵甘露糖。運動性試驗中僅有1株菌運動性呈陰性，其他均為陽性。IMViC試驗中，吲哚（I）試驗均為陽性，甲基紅（M）試驗均為陽性，VP（V）試驗均為陰性，枸櫞酸鹽（C）利用試驗均為陰性。產(chǎn)硫化氫（H2S）試驗均為陰性，尿素酶試驗均為陰性，觸酶試驗均為陽性（表1，2）。

表1　大腸桿菌HL1～17分離株的生化特性Table 1 Results of biochemical characteristics of HL1～17

表2　大腸桿菌HL18～34分離株的生化特性Table 2 Results of biochemical characteristics of HL18-34

2.3雞胚致死試驗 38株大腸桿菌雞胚致死試驗中，6株致死率為0%，5株致死率為10%，5株致死率為20%，3株致死率為30%，6株致死率為40%，5株致死率為50%，4株致死率為60%，2株致死率為70%，2株致死率為80%，對照PBS組、未注射組均無死亡，具體結(jié)果見表3。

表3　大腸桿菌分離株雞胚致死結(jié)果Table 3 Results of lethality test of E.coli isoloates in chicken embryos

用SPSS19.0進行分析，90%置信區(qū)間為（25.1%，38.4%），其中19株為致病力較強菌株，分別為HL2、HL4、HL8、HL11、HL12、HL13、HL14、HL15、HL16，HL21、HL26、HL28、HL29、HL32、HL33、CVCC1551、CVCC1553、CVCC1562、CVCC1568；16株為致病力較弱或無致病力菌株，分別為HL1、HL3、HL5、HL6、HL7、HL9、HL17、HL18、HL19、HL20、HL22、HL24、HL25、HL27、HL31、HL34；3株為中等致病力菌株，分別為HL10、HL23、HL30。

2.4套式PCR檢測結(jié)果 經(jīng)第一輪PCR檢測發(fā)現(xiàn)33株菌株第一輪PCR均可檢測到大小為416 bp的iss基因擴增片段，5株菌在該位置條帶模糊或不可見，但第二輪PCR均可擴增出大小為363 bp的iss基因片段，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1　大腸桿菌iss基因第一輪PCR擴增結(jié)果Fig. 1 Electrophoretogram of one step PCR amplifi cation for iss gene

圖2　大腸桿菌iss基因第二輪PCR擴增結(jié)果Fig. 2 Electrophoretogram of nested PCR amplifi cation for iss gene

3　討論

本研究分離了34株大腸桿菌，其中有些菌株生化特性較特殊，與大多數(shù)菌株不同。HL4、HL7、HL21、HL25、HL26、HL28、HL29、HL30共8株不發(fā)酵蔗糖。王廷富等［8］分離的96株大腸桿菌有57株不發(fā)酵蔗糖；周繼勇等［9］分離的13株大腸桿菌中有4株不發(fā)酵蔗糖。劉玉濤等［10］分離的12株大腸桿菌中有6株不發(fā)酵蔗糖。張遂平等［11］分離的50株大腸桿菌均不發(fā)酵蔗糖，HL21、HL22、HL26不發(fā)酵木糖。王廷富等［8］分離的96株大腸桿菌有1株不發(fā)酵木糖，共有15株運動性呈陰性。

iss基因是大腸桿菌的重要毒力因子，能夠增強大腸桿菌在血清中的存活能力，有很多學(xué)者認為iss基因的存在與大腸桿菌的致病力高度相關(guān)［4，12］。本研究采用套式PCR對iss基因進行檢測，大多數(shù)菌株均可由PCR檢測出iss基因，僅少數(shù)菌株（HL24、HL31-34）第一輪PCR條帶較為模糊或不可見，但是第二輪PCR均有明亮條帶，iss基因檢測陽性率為100%，因此我們推測iss基因在大腸桿菌中是廣泛存在的。但是致病力試驗結(jié)果表明，各大腸桿菌的致病力是有區(qū)別的，由此推斷，iss基因的存在和大腸桿菌的毒力無關(guān)。不同菌株中iss基因的拷貝數(shù)是不同的［13］。這也可能是很多研究學(xué)者采用多重PCR或其他普通PCR方法檢測大腸桿菌時，iss 基因檢出率并未達到100%的原因之一。Jenog等［14］運用普通PCR方法檢測101株大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)其中78.2%的菌株可檢測到 iss 基因。Catana等［7］通過多重PCR對121株大腸桿菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)63.6%的大腸桿菌能檢測到iss基因。Mohamed等［15］通過普通PCR檢測發(fā)現(xiàn)121株大腸桿菌中72.2%的菌株有iss基因。

胚胎致死試驗可作為檢驗雞大腸桿菌致病力強弱的一種方法［17］。Gibbs等［18］通過檢測多種毒力因子與雞胚致死結(jié)果相比較后發(fā)現(xiàn)，雞胚致死試驗可以提供一種判斷大腸桿菌是否具有毒力的檢測手段。Borst等［19］通過盲腸腸球菌接種雛雞和雞胚，發(fā)現(xiàn)雞胚致死試驗為理解毒力的遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了一種有效的手段，但雞胚不能控制感染及表現(xiàn)典型的敗血癥特征。Oh等［20］研究了大腸桿菌毒力基因與其致病力的關(guān)系。本研究細菌稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚，連續(xù)觀察4 d，結(jié)果用SPSS 19.0進行90%置信區(qū)間分析。其中50%為致病力較強菌株，42.1%的菌株為致病力較弱或無致病力菌株，7.9%為中等致病力菌株，未見雞胚致死率達100%的菌株。致病力試驗進一步證明了iss基因的存在與菌株毒力關(guān)系沒有直接的關(guān)系。

綜上所述，iss基因在大腸桿菌中可能是廣泛存在的，大腸桿菌的毒力與iss基因的存在無關(guān)，但iss基因?qū)Χ玖τ绊憴C制及iss基因序列差異對毒力影響還需進一步的研究驗證。

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ISOLATION AND PATHOGENICITY OF 34 STRAINS OF ESCHERICHIA COLI FROM CHICKENS

XU Wang-ye1， FAN Chen2， QIAO Xin-yuan1， TANG Li-jie1， LIU Min1， WANG Li1，XU Yi-gang1， JIANG Yan-ping1， CUI Wen1， LI Yi -jing1

（1. College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 2. Agricultural College of Liaocheng University， Liaocheng 252059， China）

A total of 34 E.coli trains were isolated and identifi ed from chicken cloacal samples. These strains along with other 4 strains purchased from China Institute of Veterinary Drugs Control were inoculated into chicken embryos to examine their virulence. The software SPSS 19.0 was applied to calculate a 90% confi dence interval. Among tested 38 strains， 19 strains were virulent strains as their rates of lethality were higher than the upper limit 38.4%， 16 strains were least or non-pathogenic as their rates of lethality were lower than the lower limit 25.1% and the remaining 3 strains were medium virulent as their rates of lethality were between the upper and lower limits. The iss （increase serum survival） gene was detected in nested PCR and the positive rate was 100%. The result showed that the presence of the iss gene in E.coli was ubiquitous while the virulence of these 38 strains was different， which suggested that the iss gene was not relevant to virulence of E.coli.

E.coli； pathogenicity； nested PCR； iss gene， isolation； identifi cation

S852.612

A

1674-6422（2016）05-0041-07

2016-01-28

國家自然科學(xué)基金（31302128）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201410447041）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201410447039）

徐旺燁，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李一經(jīng)，E-mail：yijingli@163.com