王 艷，張小文，王 政，邱 璐

（1. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2. 山東出入境檢驗檢疫局食品農產品檢測中心，青島 266002；3. 上海市浦東新區(qū)農產品安全檢測中心，上海 201202）

·研究論文·

三種馬源病原體三重實時熒光定量PCR檢測方法的建立

王 艷1，張小文2，王 政3，邱 璐1

（1. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2. 山東出入境檢驗檢疫局食品農產品檢測中心，青島 266002；3. 上海市浦東新區(qū)農產品安全檢測中心，上海 201202）

通過對GenBank中馬鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei）、亨德拉病毒（Hendra virus，Hev）和西尼羅熱病毒（West nile virus，WNV）的主要基因進行分析比較，分別設計合成了引物和TaqMan 熒光探針，對反應條件和試劑濃度進行優(yōu)化，建立了能同時檢測這3種病原的三重實時熒光定量PCR方法。本研究建立的三重熒光定量PCR具有良好的特異性、敏感性和重復性，適合于大批量樣品的檢測，可廣泛用于出入境馬匹這3種病原體的檢疫。

馬鼻疽伯克霍爾德氏菌；西尼羅熱病毒；亨德拉病毒；實時熒光定量PCR

西尼羅病毒（West nile virus，WNV）屬于黃病毒科、黃病毒屬，主要通過蚊媒傳播，1937年首次被分離［1，2］。WNV被認為在蚊-鳥-蚊的傳播循環(huán)過程中增殖，多數(shù)種類的鳥類和蚊類都支持病毒的復制，而且大部分鳥類在感染后并不出現(xiàn)明顯的癥狀［3，4］。人和馬被認為是WNV的終端宿主。目前報道的WNV爆發(fā)都源自WNV的I型病毒。哺乳動物感染W(wǎng)NV后可出現(xiàn)不同程度和不同癥狀的臨床表現(xiàn)，嚴重的可影響神經系統(tǒng)，引起西尼羅腦炎。

亨德拉病毒（Hendra virus，HeV）是一種新型人畜共患病病毒，主要感染人和馬。HeV感染首次暴發(fā)于1994年澳大利亞昆士蘭州布里斯班郊區(qū)的亨德拉鎮(zhèn)，14匹賽馬出現(xiàn)嚴重的急性呼吸道疾病，最終全部死亡，并有2人感染死亡。1994～2008年，昆士蘭州其他地方也出現(xiàn)該病，每次僅有1～2匹馬出現(xiàn)急性死亡。在人感染致死的病例中，這些人在治療、護理和剖檢馬匹時，都與病重、垂死或死亡馬匹的分泌物或組織有過直接接觸，分別為馴馬師、飼養(yǎng)員、獸醫(yī)和農民［5，6］。

馬鼻疽是由鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei）引起的一種人畜共患傳染病，主要流行于馬屬動物中，虎、獅、狗等肉食動物也可因采食患畜的肉和內臟而被感染。馬鼻疽通常呈慢性經過，可存活幾年，鼻腔結節(jié)可造成鼻腔流出粘稠的黃色分泌物，肺臟結節(jié)則可伴有進行性衰竭、發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難等。驢、騾發(fā)生鼻疽通常呈急性經過，出現(xiàn)高熱和呼吸道癥狀。本病的特征是在鼻腔、咽喉頭、氣管或皮膚形成特征性鼻疽結節(jié)、潰瘍或星狀瘢痕，在肺臟、淋巴結及其他實質臟器中形成鼻疽結節(jié)。2012年4月2日，巴西官方獸醫(yī)部門在動物移動控制監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)了馬鼻疽疫情，我國將其列為二類動物疫病［7，8］。鼻疽是一種復雜的傳染病，很早以前就在世界各國廣泛流行，而且大多數(shù)病畜不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，潛在的危害極大。

本研究利用Taqman熒光定量PCR技術探索可同時檢測3種馬病病原的檢測方法，從而為進出境馬匹的檢疫提供技術保障。

1　材料和方法

1.1材料和試劑 Trizol 購自Invitrogen公司；DNA抽提試劑盒、Taq Plus DNA 多聚酶和質粒小提試劑盒購自北京天根生物技術公司；AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs均購自TaKaRa公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）購自上海生工生物技術有限公司；異丙醇、無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司；ABI7500 Fast Real-time PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.13種馬源病原體基因序列的比對和合成 根據(jù)GenBank中登錄的鼻疽伯克霍爾德氏菌、西尼羅病毒、亨德拉病毒的基因序列（登錄號分別為CP000010、AY646354.1、NC_001906），進行全基因合成并克隆于質粒載體上，制備成標準品。對應的3種參考品分別命名為B125、W178、H150。

1.2.2引物及探針的設計與合成 參考相關文獻報道及序列比對分析結果，設計1對引物及相應的探針（表1）。引物和探針分別由上海翰宇生物科技有限公司和Lifetech合成。

表1　三重實時熒光定量PCR引物與探針Table 1 The primer pairs and Taqman probes in the triple real-time qPCR

1.2.3三重熒光定量PCR方法的建立

1.2.3.1反應條件的優(yōu)化和標準曲線的建立 先建立并優(yōu)化單個靶基因檢測體系，在此基礎上，逐步改變引物與探針的濃度（采用矩陣法）以達到最佳的擴增效率，獲得良好的熒光曲線，選擇擴增效果最佳的方法進行下一步試驗。使用重組質粒作為標準品制作標準曲線。標準品進行10倍稀釋，對應濃度為10～105copies/μL，作為模板進行Taqman模式的三重熒光定量PCR試驗。其中每個標準品稀釋度3個重復。以Cq值為y軸，標準品的稀釋度為x軸制作標準曲線。計算標準曲線的斜率和反應相關系數(shù)。

1.2.3.2特異性試驗 利用建立的三重熒光定量檢測方法，對實驗室保存的其他馬病陽性對照（馬病毒性動脈炎病毒、馬鼻肺炎病毒、馬流感病毒、馬焦蟲抗原、馬媾疫抗原）進行檢測，進一步確定三重實時熒光PCR方法的特異性。

1.2.3.3敏感性試驗 將人工合成的西尼羅河熱病毒、亨德拉病毒和鼻疽伯克霍爾德氏的相關基因所在的質粒作為模板，并對其進行10倍梯度稀釋，使其濃度分別為100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4ng/ μL。在相同條件下對不同濃度的模板量進行熒光定量PCR，觀察并分析結果。

1.2.3.4重復性試驗 分別對這3種病原體的三重熒光定量PCR進行組間及組內的重復性試驗。組間試驗為分別為1個月、2個月和3個月從同一管樣品中取出模板進行Taqman模式的三重熒光定量PCR，組內試驗是每次每個樣品進行3個重復，觀察并分析結果。

2　結果

2.1重組質粒的濃度測定 3種參考品干粉每管加入100 μL純化水，采用UV spectrophotometer Q3000測定濃度和純度，結果見表2。

表2　參考質粒的濃度測定Table 2 The concentration of the reference plasmids

2.3反應條件的優(yōu)化及標準曲線的建立 對三重熒光定量PCR各條件進行優(yōu)化后，最終確定反應體系如下：TaqMan Mixture（2×）12.5 μL、WF/WR 0.15μL、HF/HR 0.2 μL、BF/R 0.1 μL、WP1/2 0.08μL、BP 0.05 μL、HP 0.08 μL、模板5 μL，用滅菌ddH2O補足至25 μL。體系中所用引物和探針的濃度均配成10 pmol/mL。95℃預變性10 min；95℃變性25 s，60℃退火并延伸32 s，擴增45個循環(huán)；在60℃結束開始收集熒光信號，全部擴增檢測在60 min內完成。

重組質粒標準品在濃度10～105copies/μL間均能檢測出熒光信號，擴增曲線圓滑平整，且標準曲線均具有良好的線性關系，R值均在0.99以上。三重熒光定量PCR對3種標準品的檢測結果如圖1、2、3。

圖1　檢測體系對W178參考品的檢測擴增曲線Fig. 1 The standard curve of Real-time qPCR for W178

圖2　檢測體系對H150參考品的檢測擴增曲線Fig. 2 The standard curve of Real-time qPCR for H150

圖3　檢測體系對B125參考品的檢測擴增曲線Fig. 3 The standard curve of Real-time qPCR for B125

2.4cut-off值的初步確定 采用檢測體系針對陰性對照（純化水）進行40次重復檢測，設定熒光閾值為1萬并觀察4個檢測通道的Ct值情況，按照非特異性反應產生的最小Ct值作為檢測試劑初步的cut-off值（圖4）。檢測結果，初步將Fam、Rox和Vic的通道的Cut-off值確定為38、37.5和37。

圖4　針對陰性對照40次重復檢測的擴增結果Fig. 4 The repeatability test of the triple Real-time qPCR for negative controls

2.5特異性試驗 所建立的三重熒光定量PCR體系對這3種病原都能檢測出各自的擴增曲線，對其他對照病毒、細菌均未出現(xiàn)擴增曲線（圖5），判為陰性，說明該檢測方法具有良好的特異性。

圖5　三重熒光定量PCR特異性試驗結果Fig. 5 The amplication curves of the triple Real-time qPCR in specifi city test

2.6敏感性試驗 經檢測，3種重組質粒在10 copies/ μL時仍能檢測出熒光信號值（圖6），說明建立的三重熒光定量PCR具有較高的敏感性。

2.7重復性試驗 取105、104、103、102、10 copies/ μL 3組不同濃度的標準品質粒，每組做3次重復檢測。對結果進行統(tǒng)計學分析，結果顯示變異系數(shù)均小于3%，重復性較好。

3　討論

病毒的分離是病毒檢測的最基本方法，但存在樣本選取問題、耗時等缺陷，特別不利于快速檢驗篩查工作。血清學抗體檢驗是臨床診斷的主要依據(jù)，卻存在與其他相近病毒屬，如日本腦炎病毒、登革病毒或圣路易斯腦炎病毒、尼帕病毒交叉反應的問題。近年來發(fā)展的核酸PCR檢測技術越來越受到重視，它耗時短，操作簡便，幾乎適用于所有的樣本，特別是實時熒光PCR檢測方法，準確率更高，耗時更短，特別適用于復雜對象樣本的快速篩查。

本研究建立的熒光定量檢測方法，陽性樣品和其他樣品的熒光信號曲線分離顯著，陽性樣品擴增曲線典型，證明建立的方法有較好的特異性。同時經多次靈敏度對比試驗，證實該實時熒光PCR與常規(guī)的方法相比，具有良好的相關性。結果表明本研究建立的實時熒光PCR方法，反應所需時間短，特異性較好，而且在封閉的系統(tǒng)中操作，減少了交叉污染和操作人員感染的機會，特別適用于高通量的監(jiān)測工作。

圖6　三重熒光定量PCR檢測的敏感性試驗Fig. 6 The sensitivity results of the triple Real-time qPCR

口岸檢驗檢疫工作所接觸的樣本種類繁多，如人類血清或組織樣本、活動物血清活組織樣本、動物產品樣本、蚊蟲樣本、鳥類樣本，甚至可疑的非生物樣本等，特別是可疑人群或蚊鳥等傳播媒介，需要的檢測方法必須適用范圍廣泛，而熒光（RT）-PCR方法中樣本的前處理方法，操作簡單，幾乎可以用于所有類型的樣本中這3種病原的檢測。

［1］ Castle E， Nowak T， Leidner U， et al. Sequence analysis of the viral coer protein and the membrane-associated proteins V1 and NV2 of the falvivirus west Nile virus and of the genome sequence for these proteins［J］. Virology，1985， 145（2）: 227-236.

［2］ 于萍， 魏榮， 王志亮， 等. 西尼羅病毒蚊媒的種類、研究進展及監(jiān)控措施［J］. 中國媒介生物學及控制雜志， 2005，16（4）: 324-328.

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DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION OF BURKHOLERIA， HEDRA VIRUS AND WEST NILE VIRUS

WANG Yan1， ZHANG Xiao-wen2， WANG Zheng2， QIU Lu1

（1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shanghai 200135， China； 2. The Food and Agricultural Products Testing Agency of Shandong Entry-Exit Inspection and Quaratine Bureau， Qingdao 266002， China； 3. Agricultural Products Safety Testing Center of Shanghai Pudong New District， Shanghai 201202， China）

A multiplex real-time PCR was developed using the primers and probes designed according to the highly conserved regions of genes of Burkholderia mallei， Hendra virus and West Nile virus reported in GenBank. The results showed that this assay was sensitive，specifi c and reproducible for detection of entry and exit equine samples.

Burkholderia mallei； West nile virus； Hendra virus； real-time PCR

S852.659.6

A

1674-6422（2016）04-0036-05

2015-12-23

上海檢驗檢疫局科技計劃項目（HK002-2015）

王艷，女，高級獸醫(yī)師，主要從事動物檢疫工作

王艷，E-mail：wang_yan@shciq.gov.cn