何世成，鄒玖零，王衛(wèi)國，王昌建，唐小明，林 源，魯杏華，邱立新

（1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，長沙 410014；2.永州市動物疫病預(yù)防控制中心，永州 425000）

·研究論文·

小反芻獸疫病毒野毒與疫苗毒雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測方法的建立

何世成1，鄒玖零2，王衛(wèi)國1，王昌建1，唐小明1，林 源1，魯杏華1，邱立新1

（1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，長沙 410014；2.永州市動物疫病預(yù)防控制中心，永州 425000）

對GenBank中的小反芻獸疫野毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）及疫苗毒株的基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計兩對引物和兩條特異探針，建立小反芻獸疫病毒野毒與疫苗毒株的雙重?zé)晒釸T-PCR鑒別檢測方法。特異性檢測表明，建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法，可特異檢測野毒（FAM通道）和疫苗毒（VIC通道）。靈敏度實驗表明，F(xiàn)AM通道可檢測到10-5稀釋度的RNA （3.576 ng/mL），VIC通道可檢測到10-3稀釋度的RNA（27.6 ng/mL）。重復(fù)性實驗表明，該雙重?zé)晒釸T-PCR方法重復(fù)性較好。用建立的二重?zé)晒釸T-PCR方法對20份組織樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，該方法可以有效區(qū)分野毒和疫苗毒株，且野毒檢測結(jié)果與實驗室確診陽性結(jié)果一致，可以用于臨床檢測。

小反芻獸疫病毒；野毒；疫苗毒；熒光RT-PCR；鑒別

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）是一種烈性、高度接觸性傳染病，該病危害嚴(yán)重，是需要采取強(qiáng)制預(yù)防、控制、封鎖、撲殺的Ⅰ類動物疾病［1］。PPR由副粘病毒科、麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起，主要感染小反芻獸，特別是綿羊和山羊，不感染人。PPR 可通過多種方式傳播，排泄物、污染物、氣溶膠等都可以成為傳染源［2］，發(fā)病率和死亡率分別可達(dá)到100%和90%，若繼發(fā)感染其他疾病，死亡率可達(dá)到100%［3］。小反芻獸疫目前主要流行于非洲中西部、阿拉伯半島、中東及南亞次大陸等。

PPRV是不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，已公布的疫苗株長度為15 948 bp，編碼8種蛋白［4，5］。根據(jù)PPRV F、H、N基因的序列變異情況，將其分為4個基因群［6］，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，我國流行的毒株均為Ⅳ型。目前該病毒僅有1個血清型。PPR主要通過疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防，而隨著疫苗免疫的大面積推廣運(yùn)用，僅依靠血清學(xué)檢測方法及通用型病原學(xué)檢測方法不足于應(yīng)對臨床疫病診斷。目前關(guān)于小反芻獸疫野毒及疫苗毒株的相關(guān)鑒別診斷較少，因此有必要建立一種雙重?zé)晒釸T-PCR方法，用以鑒別診斷小反芻獸疫野毒株與疫苗毒株。本研究設(shè)計了引物及探針，建立了可同時檢測野毒和疫苗兩種核酸的雙重?zé)晒釸T-PCR方法。

1　材料與方法

1.1樣品標(biāo)準(zhǔn)品 PPR臨床陽性樣品（PPR野毒）為經(jīng)國家外來動物疫病研究中心確診的病例樣品；口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）標(biāo)準(zhǔn)品為滅活后的FMDV培養(yǎng)物，來自蘭州獸醫(yī)研究所；PPR弱毒苗（Nigeria75/1）為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；犬瘟熱疫苗為法國梅里亞公司產(chǎn)品；羊口瘡疫苗為山東泰豐生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2主要設(shè)備和試劑 ABI7500實時熒光PCR儀購自ABI公司；美國NanoVue超微量紫外分光光度計購自GE公司；核酸提取儀和核酸提取試劑盒（磁珠法）購自天隆科技公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit 購自TaKaRa公司；比較用PPRV熒光RT-PCR檢測商用試劑盒分別來自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司（PPR20150626P）和國家外來動物疫病研究中心（PPR20150612H）。

1.3臨床樣品 來自于湖南各市州的20份臨床組織樣品。

1.4病毒RNA提取 將組織樣品及疫苗前處理后，用全自動核酸提取儀提取野毒和疫苗毒RNA，紫外分光光度計測RNA的濃度和純度。將已知濃度的RNA，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，共8個梯度，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5引物和探針的設(shè)計和合成 將基因庫中已報道的PPR中國野毒株與疫苗毒株Nigeria75/1的基因序列進(jìn)行分析比較結(jié)果見表1。分別選擇野毒株和疫苗株的保守序列設(shè)計熒光定量RT-PCR引物和Taqman探針，Blast比對引物和探針特異性后，送由上海生工合成并標(biāo)記，具體序列及擴(kuò)增長度見表2。

表1　本研究所用PPRV基因序列Table 1 Gene sequences of PPRV in this study

表2　熒光定量RT-PCR引物和探針序列Table 2 Primers and probes sequence of fl uorescence quantitative RT-PCR

1.6熒光定量RT-PCR檢測方法的建立 參照TaKaRa One Step PrimeScript RT-PCR Kit說明書，以提取的2種RNA為模板在進(jìn)行單項RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，將兩種方法組裝，建立雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×buffer 10 μL、ExTaqTMHS 0.4 μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4 μL、F-F2 （20 μmol/L）0.2 μL、F-R2（20 μmol/L）0.2 μL、F-P2（20 μmol/L）0.4 μL、N-F（20 μmol/ L）0.2 μL、N-R（20 μmol/L）0.2 μL、N-P（20 μmol/L）0.4 μL、50×ROX 0.4 μL、RNA模板各3 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件：42℃，5 min；95℃，10 s；95℃，5 s，60℃，34 s，40個循環(huán)。

1.6.1反應(yīng)條件優(yōu)化 參照TaKaRa One Step Prime Script RT-PCR Kit說明書，以提取的RNA為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)，對引物和探針濃度進(jìn)行方陣實驗篩選最優(yōu)濃度。疫苗引物和探針濃度為：4、6、8 pmol/μL，野毒引物和探針濃度：6、8、10 pmol/μL。

1.6.2敏感性試驗 將10倍梯度稀釋的兩種RNA，自高到低依次作為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)，設(shè)立空白陰性對照，確定該方法的最低檢測濃度。

1.6.3重復(fù)性試驗 選取10-1梯度PPRV野毒株RNA，100梯度PPRV疫苗株RNA，在同一次反應(yīng)中每個樣重復(fù)6次，進(jìn)行重復(fù)性實驗，設(shè)陰性對照，并統(tǒng)計變異系數(shù)。

1.6.4特異性實驗 將分別提取的PPR野毒、PPR疫苗毒、口蹄疫病毒、犬瘟熱疫苗毒及羊口瘡疫苗毒核酸作為模板進(jìn)行特異性實驗，同時設(shè)立陰性對照。1.6.5 臨床樣品的檢測 對來自湖南省部分地區(qū)20份臨床疑似PPR組織樣品，提取RNA，運(yùn)用本研究建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法進(jìn)行檢測，并與2種商用試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2.1反應(yīng)體系的優(yōu)化 結(jié)果表明，當(dāng)疫苗引物為4 pmol/μL、探針為8 pmol/μL時，CT值最小；當(dāng)野毒引物為8 pmol/μL、探針為10 pmol/μL時，有最小CT值和最佳擴(kuò)增曲線。優(yōu)化后的反應(yīng)程序：2×buffer 10 μL、Ex TaqTM HS 0.4 μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.4μL、F-F2（20 μmol/L）0.2 μL（4 pmol/μL）、F-R2（20 μmol/ L）0.2μL（4 pmol/μL）、F-P2（20 μmol/L）0.4 μL（8 pmol/μL）、N-F（20 μmol/L）0.4 μL（8 pmol/μL）、N-R（20 μmol/L） 0.4 μL（8 pmol/μL）、N-P（20 μmol/L）0.5 μL（10 pmol/ μL）、50×ROX 0.4 μL、RNA模板各3 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件：42℃，5 min；95℃，10 s；95℃，5 s，60℃，34 s，40個循環(huán)。

2.2敏感性試驗 提取的PPR疫苗RNA，測得濃度為27.6 μg/mL，提取的PPR野毒RNA測得濃度為357.6 μg/mL，分別10倍梯度稀釋（100～10-7）后進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果表明該雙重?zé)晒釸T-PCR方法，可以檢測到疫苗株的最低稀釋度為10-3，相當(dāng)于27.6 ng/mL的RNA；檢測野毒株的最低稀釋度為10-5，相當(dāng)于3.576 ng/mL總RNA（圖1）。

圖1　雙重?zé)晒舛縍T-PCR敏感性試驗擴(kuò)增曲線Fig. 1 Amplifi cation curve of sensitivity assay of dual fl uorescence RT-PCR

2.3重復(fù)性試驗 陰性對照未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，疫苗株變異系數(shù)為0.91%，野毒株變異系數(shù)0.38%，見表3，表明重復(fù)性很好，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

2.4特異性試驗 用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法對PPR野毒、PPR疫苗毒、口蹄疫病毒、犬瘟疫苗毒及羊口瘡疫苗毒核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示FAM通道只檢出PPR野毒，VIC通道只對小反芻獸疫疫苗的檢測出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線（圖2），其他病毒及陰性對照的檢測雙通道均為陰性，表明本研究建立的方法特異性很好，可以用于PPR野毒和疫苗的鑒別診斷。

2.5臨床樣品的檢測 采用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法與2種商用熒光RT-PCR檢測試劑盒，對20份臨床疑似PPR組織病料進(jìn)行同時檢測，結(jié)果顯示，建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法疫苗毒結(jié)果均為陰性，野毒檢測結(jié)果有11個樣品陽性，與2種商用的熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測結(jié)果一致，符合率為100%。

表3　雙重?zé)晒舛縍T-PCR重復(fù)性檢測Table 3 Repetitive assay for dual fl uorescence RT-PCR

3　討論

小反芻獸疫有4個基因型，1個血清型，我國主要流行的是Ⅳ系毒株［7］，疫苗毒株也屬于Ⅱ系。隨著小反芻獸疫在我國的暴發(fā)和流行，控制小反芻獸疫在我國的傳播應(yīng)該從傳染源、傳播途徑、易感動物三方面入手，其中保護(hù)易感動物的最有效措施是注射弱毒疫苗［8］。然而，疫苗的使用勢必會使小反芻獸疫的流行病學(xué)調(diào)查、感染監(jiān)測和評估變得愈發(fā)困難，因此有必要建立一種區(qū)分小反芻獸疫野毒和疫苗毒株的方法。

現(xiàn)有的小反芻獸疫診斷方法，如病毒分離、ELISA、RT-PCR等雖然能夠檢測出小反芻獸疫病毒，但在敏感性、特異性、時效性和結(jié)果判斷等方面存在一定缺陷，同時也不能準(zhǔn)確、特異的區(qū)別野毒株和疫苗株［9-11］。本研究在單一熒光RT-PCR的基礎(chǔ)上，建立了鑒別診斷小反芻獸疫野毒和疫苗株的雙重?zé)晒釸T-PCR方法。該方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度較高，可以同時檢測到2種病毒，不僅節(jié)省了試劑和耗材，也縮短了檢測過程，簡化了實驗流程。

在進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)時，因為多對引物和多種探針的混合存在，勢必相互之間會發(fā)生一定的影響，因此需特別注意與反應(yīng)有關(guān)的一些因素，包括引物和探針的設(shè)計、引物探針的濃度、退火溫度等。首先，引物不能過長，一般20 bp左右，避免造成引物間相互纏繞，影響反應(yīng)進(jìn)行；其次，引物需具有特異性，且多重反應(yīng)中各引物之間Tm值差距限制在2℃范圍內(nèi)，避免非特異性擴(kuò)增，同時保證同一體系中各引物擴(kuò)增效率。本研究設(shè)計的2對特異性引物的Tm值相差僅0.8℃，使得在同樣退火溫度下各目的片段都能夠獲得較好的擴(kuò)增效率。在實驗中還要注意引物濃度，引物濃度過低則不能擴(kuò)增出特異的目的基因，引物濃度過高會抑制多重RTPCR反應(yīng)［12］。探針要高度特異，純度要高且穩(wěn)定性要好。

圖2　雙重?zé)晒舛縋CR特異性試驗擴(kuò)增曲線Fig. 2 Amplifi cation curve of specifi city assay of dual fl uorescence RT-PCR

建立的雙重?zé)晒釸T-PCR對臨床樣品的檢測中，野毒（FAM）通道有11個陽性，疫苗毒（VIC）通道無特異擴(kuò)增，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，該樣品未注射疫苗，VIC通道應(yīng)該為陰性，且與北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司和國家外來動物疫病研究中心2種商品化試劑盒的檢測結(jié)果一致，說明檢測結(jié)果是準(zhǔn)確的。2種商品化試劑盒是標(biāo)準(zhǔn)化批量產(chǎn)品，各種組分已提前混合保存，配制過程方便快捷，質(zhì)量較穩(wěn)定，而本研究建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法試劑組分較多，使用時的配制過程較繁瑣，較易出錯和受到外界干擾，但是該方法比2種商品化試劑盒的檢測時間短，在1 h內(nèi)就可以得到檢測結(jié)果，成本也較低，且可以鑒別檢測野毒和疫苗毒，在臨床診斷中更適用、更便捷。

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DEVELOPMENT OF DUAL FLUORESCENCE RT-PCR FOR DIFFERENTIATION OF WILD STRAIN AND VACCINE STRAIN OF PESTE DES PETITS RUMINANTS VIRUS

HE Shi-cheng1， ZOU Jiu-ling2， WANG Wei-guo1， WANG Chang-jian1， TANG Xiao-ming1， LIN Yuan1，LU Xing-hua1， QIU Li-xin1

（1. Animal Disease Prevention and Control Center of Hunan Province， Changsha 410014， China； 2. Animal Disease Prevention and Control Center of Yongzhou， Yongzhou 425000， China）

Two pairs of primers and two specifi c probes were designed based on the genome sequences of wild isolates and vaccine strain of Peste des petits ruminants virus （PPRV） published in GenBank. Subsequently， a dual fl uorescence RT-PCR assay was developed for differentiation of PPRV wild isolates and vaccine strain. The specifi city testing indicated that the dual fl uorescence RT-PCR assay revealed difference between wild isolate （FAM） and vaccine strain （VIC）. The sensitivity test showed that its detection limits were 10-5dilution degrees （3.576 ng/mL） RNA in FAM channel and 10-3dilution degrees RNA （27.6 ng/mL） in VIC channel. Additionally， 20 tissue samples were examined using the dual fl uorescent RT-PCR assay. The positive samples were confi rmed through other laboratory tests. The results demonstrated the reliability of the assay to differentiate vaccinated animals from fi eld infected animals.

Peste des petits ruminants virus； wild isolate； vaccine strain； fl uorescence RT-PCR； differentiation

S852.659.5

A

1674-6422（2016）04-0031-05

2016-01-12

何世成，男，碩士，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疾病防控工作

鄒玖零，E-mail：849108910@qq.com