朱小甫，吳旭錦

（咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，咸陽(yáng) 712000）

·研究論文·

鑒別偽狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒與野毒套式PCR方法的建立

朱小甫，吳旭錦

（咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，咸陽(yáng) 712000）

為建立一種能夠鑒別偽狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒與野毒套式PCR方法，根據(jù)GenBank上發(fā)表的偽狂犬病毒gD、gE基因序列，設(shè)計(jì)并合成了4對(duì)引物，對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，建立復(fù)合套式PCR方法。通過(guò)靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、病料中PRV檢測(cè)對(duì)比等方法驗(yàn)證建立方法的適用性。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)的極限為2.78×10-4pg/L，并且僅能從PRV野毒株擴(kuò)增出354、217 bp目的條帶，PRV疫苗擴(kuò)增出了217 bp單條帶，其他5種常見(jiàn)感染豬的病毒均為陰性。

偽狂犬病毒；gD基因；gE基因；鑒別診斷；套式PCR

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）又名奧葉茲基氏病，是由皰疹病毒科（Herpesvirdae），α-皰疹病毒亞科（Alpherpesvirinae）中的偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的一種或多種動(dòng)物感染的急性傳染病，迄今仍是我國(guó)主要的豬群傳染病之一［1］。PRV可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎；新生仔豬衰竭死亡，死亡率可達(dá)100%；成年豬多呈隱性感染，長(zhǎng)期帶毒排毒，危害巨大［2］。在我國(guó)，自1984年劉永純首次報(bào)道偽狂犬病后，迄今為止已有20多個(gè)省份相繼發(fā)生該病，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)特別是集約化養(yǎng)豬造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失［3］。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PCR技術(shù)以其快速、敏感、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疫病診斷中得到了廣泛應(yīng)用［4-6］。Harding等［7］針對(duì)gD基因設(shè)計(jì)引物，改進(jìn)了PRV PCR檢測(cè)方法。Jestin等［9］從鼻拭子抽提核酸，通過(guò)擴(kuò)增PRV的gD基因序列檢測(cè)出偽狂犬病毒。Talmage等［9］應(yīng)用gB基因引物對(duì)活檢的扁桃體細(xì)胞和實(shí)質(zhì)組織進(jìn)行擴(kuò)增，能應(yīng)用于潛伏感染的檢查。國(guó)內(nèi)婁高明等［10］、呂建強(qiáng)等［11］也分別建立了檢測(cè)PRV的PCR方法，可用于偽狂犬病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

疫苗免疫接種是防制乃至根除偽狂犬病的主要手段之一。西方許多國(guó)家制定的根除狂犬病計(jì)劃均需依賴于基因缺失疫苗的免疫接種［12］。我國(guó)也一直采用疫苗預(yù)防為主的防控策略，廣泛使用的Bartha-K61株弱毒疫苗基因中，具有整個(gè)gE和大部分gI基因序列缺失。由于豬群疫苗免疫覆蓋率高，導(dǎo)致疫苗毒株在豬群中廣泛存在。常規(guī)PCR技術(shù)不能區(qū)分疫苗毒和偽狂犬野毒，在診斷結(jié)果的判定上存在困難。本研究擬建立一種能夠通過(guò)PCR技術(shù)直接區(qū)分檢測(cè)樣品（組織、血清及精液等）中的偽狂犬病毒為野毒還是疫苗毒，為臨床控制偽狂犬病提供一種實(shí)用方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒 參考毒株P(guān)RV SXHX株為離自戶縣某豬場(chǎng)偽狂犬野毒株；參考疫苗毒為勃林格生產(chǎn)的商品苗Bartha-K61株；豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）SXXY13株分離自旬邑縣某豬場(chǎng)；細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）SXHZ株分離自漢中市某豬場(chǎng)；豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）YLCH株分離自榆林市某豬場(chǎng)；分離毒株均由動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）均為商品疫苗毒株。

1.1.2病料 本實(shí)驗(yàn)室采集或豬場(chǎng)送檢疑似PR組織病料（包括肺臟、腦組織和扁桃體）、病豬血清以及精液樣品，分別來(lái)自咸陽(yáng)市、寶雞市、渭南市、和西安市豬場(chǎng)，共計(jì)22份，將組織材料研磨處理，12 000×g離心10 min，收集上清液-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成 PRV gD基因序列（GenBank登錄號(hào)：AY217094），PRV gE基因序列（GenBank登錄號(hào)：AY170318），設(shè)計(jì)并合成了4對(duì)引物。PRVgD-1F：5'-TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' （2 6～4 6 b p），P R Vg D-1 R：5'-CGCCCTCAGGAATCGGAC -3'（712～731 bp）；PRgE-1F：5'-GTTCAGAGCATGCGC CGG-3'（20～41 bp），PRgE-1R：5'- CGACA GCAGCCAGACGC -3'（1387～1368 bp）；PRVgD-2F：5'- GACCGAGCACGAGGTGCG-3'（484～504 bp），PRVgD-2R：5'- GTCCACGCGCGCCTTGA -3'（6 8 0～7 7 0 b p）；P Rg E-2 F：5'-ATCGCGATCGGCGAGTCA -3'（465～484 bp）；PRgE-2R：5'- CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3'（818～797 bp）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，均用DEPC處理水稀釋到20 μmol/mL。

1.2方法

1.2.1PRV DNA的提取 取PRV SXHX株細(xì)胞培養(yǎng)物200 μL置于無(wú)菌EP管，加入DNAzol Reagent 1000 μL，上下顛倒混勻，室溫靜置裂解10 min；4℃、10 800×g離心5 min，吸取600 μL上清液轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌EP管，加入等體積冰冷無(wú)水乙醇沉淀10 min，4℃、10 800×g離心10 min；棄去上清液，加入1 mL冰冷的70%乙醇清洗2次，倒置干燥，用40 μL NaOH（8 mmol/L）充分吹打溶解，置沸水浴中10 min，取出后冰浴3 min，在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定DNA的含量。

1.2.2PRV nPCR方法的建立 取已知濃度的DNA溶液做為模板，摸索擴(kuò)增條件。第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA 2.0 μL，2×GC Buffer 12.5 μL，dNTP 1.0 μL，PRVgD-1F、PRVgD -1R、PRVgE-1F、PRVgE -1R各0.5 μL，改變r(jià)Taq DNA聚合酶用量（0.25～1.0 μL），用超純水補(bǔ)足總體積25.0 μL。條件設(shè)定：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火溫度由60℃～65℃按1℃遞增設(shè)定退火1 min，72℃延伸 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增時(shí)取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，其他成份同第1次擴(kuò)增進(jìn)行設(shè)定摸索，只是引物更換為PRVgD-2F、PRVgD -2R、PRVgE-2F、PRVgE -2R。條件設(shè)定：95℃預(yù)變性5 min； 94℃變性1 min，退火溫度由60℃～65℃按1℃遞增設(shè)定退火1 min，72℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。摸索出反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的最佳組合。

1.2.3PRV nPCR方法靈敏性試驗(yàn) 將DNA溶液做10倍梯度稀釋至10-9倍，分別以建立的nPCR方法對(duì)各稀釋后DNA溶液作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后取5.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中照相觀察。

1.2.4PRV nPCR方法特異性試驗(yàn) 提取CSFV、PRRSV和PEDV等病毒RNA基因組并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；按照DNAzol Reagent試劑說(shuō)明提取PRV SXHX株、PCV2 SXXY13株以及PPV SXHZ株等DNA基因組病毒模板，用建立的nPCR方法檢測(cè)，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)中觀察照相。

1.2.5病料中PRV的檢測(cè) 采用建立的檢測(cè)方法對(duì)收集的22份病料進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1PRV nPCR方法的建立 通過(guò)改變反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，確定最優(yōu)體系和條件。第1次擴(kuò)增DNA 2.0 μL，2×GC Buffer 12.5 μL，超純水7.0 μL，dNTP 1.0 μL，PRVgD-1F、PRVgD-1R、PRVgE-1F、PRVgE-1R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，總體積25.0 μL。第一次擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系：取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，體系其余組分同第1次擴(kuò)增，引物為PRVgD-2F、PRVgD -2R、PRVgE-2F、PRVgE -2R。第二次擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

2.2PRV nPCR方法的靈敏度試驗(yàn) 提取偽狂犬野毒SXHX株DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度為278 pg/ L，按照10倍梯度稀釋至10-9，用建立的方法進(jìn)行套式PCR，擴(kuò)增完畢后電泳觀察。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出354、217 bp兩個(gè)特異性條帶，檢測(cè)極限為2.78×10-4pg/L，表明建立的PCR方法靈敏度高（圖1）。

圖1　PRV nPCR方法的靈敏度檢測(cè)Fig. 1 The sensitivity of nPCR for the detection of PRV

2.3PRV nPCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果 用所建立的方法對(duì)CSFV、PRRSV、PRV SXHX株、PRV疫苗、PEDV、PCV2 SXXY13株以及PPV SXHZ株cDNA/DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有PRV SXHX株擴(kuò)增出了354、217 bp目的條帶，PRV疫苗僅擴(kuò)增出了217 bp條帶，其他5種病毒均為陰性（圖2），提示所建立的方法特異性好。

圖2　PRV nPCR方法特異性檢測(cè)Fig. 2 The specifi city of nPCR for the detection of PRV

2.4病料中PRV的檢測(cè)對(duì)比結(jié)果 提取收集的22份疑似感染PRV的組織病料、血清以及精液總DNA，用建立的nPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，nPCR方法在13份材料中擴(kuò)增出了目的條帶，陽(yáng)性率為59%，其中2條帶野毒株9份，野毒陽(yáng)性率為40.9%，單條帶疫苗毒株4份，疫苗毒陽(yáng)性率為18.2%（圖3）。

圖3　部分待檢樣品中PRV檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 The detection result of PRV from some samples

3　討論

我國(guó)使用的診斷豬偽狂犬的血清學(xué)方法有病毒分離鑒定、血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫熒光技術(shù)，分子生物學(xué)方法有PCR技術(shù)和核酸雜交技術(shù)［13］。病毒分離鑒定是診斷偽狂犬最可靠的辦法之一，但最大的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性低。血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和乳膠凝集試驗(yàn)等檢測(cè)方法是特異性好，但靈敏性較低。ELISA可區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，且靈敏度高，目前應(yīng)用廣泛［14］。但是豬群野毒抗體陽(yáng)性有可能是豬群曾經(jīng)感染野毒所引起，因此，ELISA檢測(cè)出野毒抗體陽(yáng)性并不能代表豬群現(xiàn)在感染偽狂犬野毒，所以在偽狂犬野毒的定性診斷上尚需要依賴病原的檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者嘗試建立相關(guān)的鑒別診斷方法，劉麗娜等［15］建立了多重PCR鑒別豬偽狂犬病野毒與疫苗毒診斷方法，可以檢測(cè)到106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。但是多重PCR方法對(duì)病料模板的純度和含量要求高于單一PCR，因此，將其應(yīng)用于臨床病理組織材料檢測(cè)，確定其臨床效果仍需進(jìn)一步的研究。藺芳等［16］也建立了多重PCR方法，設(shè)計(jì)了3對(duì)引物對(duì)4種偽狂犬疫苗樣品DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，其中1種疫苗得到與設(shè)計(jì)相符的1條特異性條帶，其余3種樣品為2條。建立的多重PCR僅檢測(cè)了純培養(yǎng)的細(xì)胞毒，沒(méi)有進(jìn)行臨床樣本的直接檢測(cè)，這一方法能否應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際，是否不需細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒分離純化而直接檢測(cè)組織或血清等材料，也需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究針對(duì)gD、gE基因設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，建立了能鑒別診斷PRV野毒株和疫苗毒株的nPCR方法。靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的方法檢測(cè)極限為2.78 ×10-4pg/L，從野毒株可擴(kuò)增出354、217 bp預(yù)期目的條帶，疫苗毒僅出現(xiàn)217 bp條帶，其他5種常見(jiàn)豬病毒均為陰性，結(jié)果提示所建立的方法特異性好，靈敏度高。從收集的22份材料（組織、血清和精液）中直接檢出了野毒株9份，疫苗毒株4份，表明本方法可直接應(yīng)用于檢測(cè)臨床不同材料，便捷直觀，不需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，為臨床快速準(zhǔn)確診斷偽狂犬提供了有力的技術(shù)保障。

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DEVELOPMENT OF NESTED PCR FOR DIFFERENTIATION OF GE GENE DELETION VACCINE AND FIELD ISOLATES OF PSEUDORABIES VIRUS

ZHU Xiao-fu， WU Xu-jin

（Animal Epidemic Disease Diagnostic Laboratory of Molecular Biology ， Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Xianyang Vocational Technical College， Xianyang 712000， China）

In order to develop a nested PCR for differentiation of gE gene deletion vaccine and fi eld isolates of Pseudorabies virus（PRV），four pairs of primers were designed and synthesized according to gD， gE gene sequences of PRV published in GenBank. The reaction factors and conditions were optimized to establish a reliable nested PCR method. The results showed that the detection limit was 2.78×10-4pg/L. The PRV fi eld strains had 354 bp and 217 bp while PRV vaccine stain had 217 bp band only in agarose gel electrophoresis. There was no amplifi cation from other fi ve common swine viruses. The complex nested PCR developed here provided a reliable method for differentiation of gE gene deletion vaccine and fi eld isolates， which could be used for clinical diagnosis of pseudorabies.

Pseudorabies virus； gD gene； gE gene； differential diagnosis； nested PCR

S852.659.1

A

1674-6422（2016）04-0026-05

2015-12-23

咸陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015k03-21）

朱小甫，男，碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究

吳旭錦，E-mail：zhuxiaofu2004@aliyun.com