楊永立，王培坤，鄒廣珍，林璐璐，韋 平

（廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，南寧 530004）

·研究論文·

廣西省2013～2015年ALV-J分離株gp85基因序列分析

楊永立，王培坤，鄒廣珍，林璐璐，韋 平

（廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所，南寧 530004）

為了解J亞群禽白血病病毒（subgroup J Avian leukosis virus，ALV-J）在廣西省雞群中的變異趨勢，對2013～2015年現(xiàn)場分離到的8株ALV-J毒株的gp85基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測序及分析比較。結(jié)果表明，8株分離病毒核苷酸及氨基酸序列同源性依次為92.5%～99.8%和89.2%～100%，與原型株HPRS-103的同源性依次為92.8%～98.1%和88.6%～97.1%，與國內(nèi)外其他分離株的同源性為92.9%～99.9%和87.6%～99.4%。位點(diǎn)的有義突變和沉默突變的比例顯示，除了2014年的1個(gè)分離株GX14YY17的高變區(qū)（hypervariable region 1，hr1）外，均未發(fā)現(xiàn)選擇壓對連續(xù)幾年的分離株的gp85基因有明顯的作用。

J亞群禽白血病病毒；gp85基因；序列分析；突變；選擇壓

禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、α反轉(zhuǎn)錄病毒屬［1］。ALV在雞中主要有A、B、C、D、E和J共6個(gè)亞群，致病性外源性病毒以A、B和J為主，目前ALV-A、ALV-B的流行雖偶有報(bào)道［2］，但已基本得到控制。J亞群ALV （Subgroup J，ALV-J）是Payne等［3］1989年首次從肉種雞群中分離出來的新亞群，該病毒迅速傳播至世界各地，我國在1999年從市場上的商品代肉雞中首次分離檢測到ALV-J［4］，隨后，在我國各省均有ALV-J感染的報(bào)道，ALV-J的致病性與傳染性高于其他亞型，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［5，6］。廣西省是我國地方品種雞資源最豐富的省份之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，該省雞群ALV的感染率較高，尤其是ALV-J［7，8］。本研究對2013～2015年從廣西省各養(yǎng)殖場分離的ALV-J的gp85基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測序與分析比較，探究ALV-J在廣西省雞群中的流行趨勢及gp85基因變異特征。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源 8株分離株為2013～2015年期間分離自廣西省各地的養(yǎng)殖場，詳細(xì)背景見表1。

表1　8株ALV-J廣西分離株Table 1 The background of 8 ALV-J strains in Guangxi

1.1.2主要儀器和試劑 DF-1細(xì)胞由廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所保存；DL2000 DNA Marker、2× Taq PCR Mix購自天根生化科技有限公司；通用型柱式基因組DNA抽提試劑盒、大腸埃希菌DH5α購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD18-T vector購自TaKaRa公司；禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒購于美國IDEXX公司；胎牛血清和DMEM購自GIBCO公司。

1.2方法

1.2.1體外培養(yǎng)及培養(yǎng)物中前病毒DNA的提取 取送檢病雞的心臟、肝臟、脾臟、腺胃，加入5倍病變組織容積的滅菌生理鹽水，混合研磨成漿并凍融3次后獲得組織勻漿，離心取上清，經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后，置于-80℃保存?zhèn)溆?。待DF-1細(xì)胞長至80%單層左右，吸棄培養(yǎng)基，接種病料的濾過液，吸附1 h以后，換為1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，9 d后收集培養(yǎng)細(xì)胞按試劑盒說明書提取DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。取?xì)胞培養(yǎng)上清置于-80℃保存待測ALV-p27抗原。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［9，10］，設(shè)計(jì)合成J亞群鑒定引物，J亞群gp85基因序列引物，引物由華大基因公司合成。引物名稱、序列以及目的片段大小見表2。

表2　本研究中PCR引物設(shè)計(jì)Table 2 PCR primers in the study

1.2.3病原鑒定 收集培養(yǎng)的DF-1細(xì)胞上清用IDEXX公司禽白血病病毒p27抗原檢測試劑盒進(jìn)行檢測。另以提取的培養(yǎng)細(xì)胞前病毒DNA為模板，用ALV-J鑒定引物H5/H7進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.4gp85基因的擴(kuò)增、克隆和測序 以病毒分離細(xì)胞提取的前病毒DNA為模板，采用P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：72℃ 5 min；95℃ 5 min；94℃40 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。1% 瓊脂凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。按照瓊脂凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定的陽性菌液送測序公司測序。

1.2.5基因序列分析 采用DNAStar 等軟件，對測序所得的gp85基因序列與GenBank上相關(guān)病毒參考株的gp85基因序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化樹分析，并對分離株gp85基因序列變異情況進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1分離株細(xì)胞培養(yǎng)物ALV-p27抗原ELISA檢測結(jié)果對收集的DF-1上清進(jìn)行ALV-p27抗原檢測。結(jié)果表明，接種病料的DF-1細(xì)胞上清檢測結(jié)果均為陽性，而對照組DF-1細(xì)胞上清為陰性。

2.2分離株P(guān)CR檢測結(jié)果 以病毒分離細(xì)胞提取的前病毒DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定和gp85基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在545 bp和924 bp處有特異性條帶（圖1），與預(yù)期片段大小一致，說明分離株為ALV-J，并且gp85基因得到擴(kuò)增。將分離的8株ALV-J分別命名為GX13DF52、GX13HG04、GX13LT02、GX14DJ53、GX14FF01、GX14YY17、GX15MM6-4和GX15PP03。

圖1　分離株的PCR鑒定（A）及gp85基因的擴(kuò)增結(jié)果（B）Fig. 1 PCR identifi cation of the virus isolates （A） and amplifi cation result of gp85 （B）

2.3分離株gp85基因測序結(jié)果與同源性分析 分離到的8株病毒之間的核苷酸同源性為93.1%～100%，氨基酸同源性為89.2%～100%，其中氨基酸同源性最高的是GX14DJ53株與GX15PP03株（同源性100%），最低的是GX14YY17株與GX14FF01株（同源性89.20%）；與國內(nèi)外分離株的核苷酸同源性為92.9%～99.9%，氨基酸同源性為87.6%～994%，其中氨基酸同源性最高的是分離株GX13LT02、 GX14DJ53、GX15PP03與參考株HUB09JY04（同源性99.4%），最低的是分離株GX14YY17與參考株NX0101（同源性87.6%）。

2.4分離株gp85氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過與國內(nèi)外分離株gp85氨基酸序列對比，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖2）。分析表明，分離株GX14DJ53、GX14FF01、GX15PP03、GX13LT02與參考株HuB09JY04處于同一進(jìn)化分支，說明這4株的親緣關(guān)系較近。同時(shí)，這4株分離株與原型株處于同一分支，說明他們與原型株都有保持較近的親緣關(guān)系。分離株GX13DF52雖然與以上4株分離株處于同一分支，但親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。GX13HG04、GX14YY17、GX15MM6-4則同屬于另一個(gè)分支。

圖2　分離株與其他參考株gp85氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the isolates and reference strains based on gp85

2.5分離株gp85基因序列變異情況分析 gp85基因高變區(qū)核苷酸序列中有義突變（nonsynonymous， NS）和沉默突變（synonymous，S）的比例顯著升高是選擇壓發(fā)揮作用的一個(gè)重要指標(biāo)，根據(jù)NS/S的比值來判斷高低，一般NS/S大于2.5就認(rèn)為有選擇壓起作用，否則就是隨機(jī)突變［11］。為探究分離株gp85基因的變異情況，將分離到的8株ALV-J的gp85基因相對變異性高的hr1（hypervariable regions 1）、hr2 （hypervariable regions 2）和vr3（variable regions 3）區(qū)域與原型株HPRS-103比較，對其NS/S比值進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，廣西省2013～2015年的ALV-J分離株與ALV-J原型株HPRS-103相比，核苷酸變異數(shù)和氨基酸變異數(shù)并無規(guī)律，8個(gè)ALV-J分離株的gp85基因的NS/S比值均小于2.5，說明選擇壓對分離株的整個(gè)gp85區(qū)域沒有明顯的作用，但分離株GX14YY17、GX15MM6-4 gp85的hr1、hr2部分的NS/S比值均增大，尤其是分離株GX14YY17的hr1大于2.5，說明選擇壓在該分離株中的hr1區(qū)域發(fā)揮了作用（表3、圖3、圖4）。

3　討論

ALV為典型的反轉(zhuǎn)錄病毒，由于基因組二聚體結(jié)構(gòu)和反轉(zhuǎn)錄酶活性的作用，反轉(zhuǎn)錄病毒通常有很高的突變頻率和重組率，從而造成了遺傳上的不穩(wěn)定性和多樣性［9］。ALV-J的前病毒基因組主要含有g(shù)ag、pol和env基因，gag和pol基因與A、B、C、D亞群有較高的同源性，而env基因差異較大，env基因的變異決定ALV-J毒株的變異，env基因編碼gp85 和gp37兩個(gè)糖蛋白，其中g(shù)p85是病毒抗原的主要成分，具有高度的可變性。ALV-J的gp85蛋白比其他亞型更易發(fā)生變異，其高變區(qū)主要集中在hr1、hr2和vr3三個(gè)區(qū)域，尤其是hr1和hr2區(qū)域更是變異集中區(qū)域［12］。

從gp85基因進(jìn)化樹分析可以看出，分離株GX14DJ53、GX14FF01、GX15PP03、GX13LT02 和GX13DF52處于同一進(jìn)化分支，說明這4株的親緣關(guān)系較近。這4株分離株與原型株處于同一分支，其中分離株GX14DJ53、GX14FF01、GX15PP03與參考株HuB09JY04同源性很高，都在99.0%以上；GX13HG04、GX14YY17、GX15MM6-4則同屬于另一個(gè)進(jìn)化分支。將8株分離株與原型株進(jìn)行同源性分析，GX14DJ53、GX14FF01、GX15PP03、GX13LT02和GX13DF52與原型株的同源性很高，均在95%以上，說明廣西省近幾年的ALV-J毒株的變異都是圍繞著原型株HPRS-103改變的。8株廣西省ALV-J分離株間的氨基酸同源性為89.2%～100%，其中分離株GX14DJ53和GX15PP03的同源性為100%，這2株分離株分離自不同地域、不同品種的雞體，推測可能是它們通過相同來源的污染活疫苗或者存在血緣關(guān)系（引種）而導(dǎo)致的ALV-J感染［13-15］。分離株GX14FF01、GX15PP03分離自廣西省不同地域的病雞，但其gp85氨基酸序列同源性為99.7%，經(jīng)核查發(fā)現(xiàn)兩病雞種苗來自同一家育種公司，推測種苗在該公司已感染ALV，從而導(dǎo)致雞發(fā)病。這就提醒養(yǎng)殖戶在購買雞苗時(shí)選擇有信譽(yù)的育種公司，同時(shí)育種公司應(yīng)做好禽白血病的凈化工作。

表3　分離株與ALV-J原型株HPRS-103基因變異比較Table 3 Genetic variations of the isolates compared with ALV-J prototype strain HPRS-103

圖3　分離株與ALV-J原型株HPRS-103 gp85氨基酸序列對比Fig. 3 Alignment of amino acid sequences of gp85 of the isolates and ALV-J prototype strain HPR-103

表4　分離株gp85基因NS/S比值分析結(jié)果Table 4 The ratio of NS/S of gp85 genes of the isolates

從分離株的ALV-J gp85與ALV-J原型株HPRS-103的氨基酸序列對比圖上可以看出，gp85蛋白的變異主要集中在hr1、hr2和vr3，vr2相對保守，在高變區(qū)hr2的181、182、183的位置有4株分離株（GX13HG04、GX14YY17、GX15MM6-4、GX13DF52）均出現(xiàn)了氨基酸的缺失。在RNA病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒的研究中，核苷酸突變和NS/S比值是研究抗原變異和選擇壓力強(qiáng)度的兩大最基本參數(shù)。從表3中可以看出，每株病毒中都存在沉默突變，說明ALV-J毒株存在很高的不穩(wěn)定性。8株分離株的gp85基因的NS/S比值都小于2.5，但分離株GX14YY17的hr1區(qū)域的NS/S為2.67，說明選擇壓對該分離株產(chǎn)生了作用，導(dǎo)致該分離株與原型株相比產(chǎn)生較大變異，同源性僅為88.6%。同時(shí)也表明選擇壓不一定對整個(gè)gp85區(qū)域都產(chǎn)生作用，可作用于高變區(qū)hr1和hr2，使這些區(qū)域的NS/S比值增大。說明這些區(qū)域是形成gp85蛋白上與病毒中和反應(yīng)相關(guān)的抗原表位的核心區(qū)域［16］。

近年來，國內(nèi)外對ALV-J的流行病學(xué)調(diào)查表明ALV-J的gp85基因有較高的變異速度，也有研究表明中國分離株的gp85與原型株HPRS-103的差異發(fā)生了同源回歸現(xiàn)象，近幾年的變化都是以原型株為原點(diǎn)在變異［17-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西省2013～2015年的ALV-J分離株主要是圍繞原型株在變異，同時(shí)廣西省是中國主要的禽類飼養(yǎng)地區(qū)，地方品種資源尤為豐富，ALV-J處于復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境中，在選擇壓的作用下再加上其本身的不穩(wěn)定性，ALV-J病毒分離株也發(fā)生了變異。

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SEQUENCE ANALYSIS OF THE GP85 GENE OF GUANGXI ALV-J FIELD STRAINS COLLECTED DURING 2013-2015

YANG Yong-li， WANG Pei-kun， ZOU Guang-zhen， LIN Lu-lu， WEI Ping

（Institute for Poultry Science and Health， Guangxi University， Nanning 530004， China）

To investigate into the mutation tendency of subgroup J Avian leukosis virus （ALV-J） in chicken populations from Guangxi province， the gp85 gene of 8 fi eld strains of ALV-J isolated during 2013-2015 were amplifi ed， cloned， sequenced and compared with the reference strains. Sequencing results revealed that the sequence similarities at nucleotide and amino acid levels were 92.5%-99.8% and 89.2%-100% among these 8 field strains， 92.8%-98.1%， 88.6%-97.1% between these 8 filed strains and the prototype ALV-J strains HPRS-103 and 92.9%-99.9% and 87.6%-99.4% with other ALV-J isolates of both domestic and international. The number of nonsynonymous and synonymous changes in gp85 gene indicated the selective pressure did not have apparent effect on the whole gene except the hypervariable variable region （hr1） of GX14YY17 strain.

Avian leukosis virus subgroup J； gp85 gene； sequence analysis； mutation； selective pressure

S852.659.3

A

1674-6422（2016）04-0019-07

2016-01-18

國家公益性（農(nóng)業(yè)）行業(yè)科研專項(xiàng)（201203055）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西肉雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（nycytxgxcxtd-04-20-2）

楊永立，女，碩士，主要從事禽病學(xué)研究

韋平，E-mail：pingwei8@126.com