于周璐，滕巧泱，崔宏銳，榮廣玉，李雪松，楊健美，陳鴻軍，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

一種共表達(dá)不同亞型禽流感病毒基因且形成病毒樣顆粒的真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

于周璐，滕巧泱，崔宏銳，榮廣玉，李雪松，楊健美，陳鴻軍，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

動物流感DNA疫苗是非常有應(yīng)用前景的新型疫苗之一，本研究構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)禽流感病毒2種血凝素H5HA和H9HA以及1種神經(jīng)氨酸酶N1NA的真核表達(dá)質(zhì)粒。間接免疫熒光結(jié)果表明，構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后，同時(shí)表達(dá)出H5HA、H9HA和N1NA蛋白；轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清通過血凝試驗(yàn)可檢測到24血凝價(jià)；通過透射電鏡觀察到了病毒樣顆粒。本研究用一種質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)不同亞型流感病毒蛋白并且形成了病毒樣顆粒，為流感病毒多價(jià)DNA疫苗研究提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

禽流感；病毒樣顆粒；H5HA；H9HA；N1NA

禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的呼吸道系統(tǒng)和全身性疾病為臨床特征的禽類烈性傳染病的總稱。禽流感病毒屬于正粘病毒科、流感病毒屬，為多形態(tài)、有囊膜、單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒。其中血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）是禽流感病毒粒子的主要表面抗原，在禽流感病毒樣顆粒的包裝及釋放過程中起主要作用，并且能夠誘導(dǎo)免疫保護(hù)的作用。

2016年H5、H9亞型禽流感在世界范圍的蔓延爆發(fā)，給當(dāng)?shù)丶仪蒺B(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，這使得對于H5、H9亞型禽流感疫苗的研制迫在眉睫。流感病毒樣顆粒是研究病毒包裝及出芽等生物學(xué)機(jī)制的手段，也是流感病毒新型疫苗開發(fā)的突破口［1-7］。研究人員主要采用重組桿狀病毒系統(tǒng)［8-10］，建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系［11］以及共轉(zhuǎn)染表達(dá)［12，13］的方法對流感病毒樣顆粒進(jìn)行研究。有研究表明HA和NA對于形成并釋放病毒樣顆粒具有重要作用［14-18］，但是也有報(bào)道顯示HA和NA在病毒的包裝釋放中不起作用［19-21］。為了驗(yàn)證插入同一表達(dá)載體的不同亞型的HA和NA基因是否能表達(dá)出相對應(yīng)的流感病毒蛋白以及是否參與流感病毒樣顆粒的形成，本研究構(gòu)建了同時(shí)能表達(dá)H5HA、H9HA和N1NA蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后，同時(shí)表達(dá)出H5HA、H9HA和N1NA蛋白，證明了該真核表達(dá)系統(tǒng)功能的完整性。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清通過血凝試驗(yàn)可以初步判斷是否有病毒樣顆粒的包裝與釋放。將轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞上清經(jīng)高離、超離等純化步驟收集病毒顆粒，通過透射電鏡觀察到了病毒樣顆粒，證實(shí)了包裝系統(tǒng)的可行性。本研究用一種質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)不同亞型流感病毒蛋白并且形成了病毒樣顆粒，為流感病毒多價(jià)DNA疫苗研究提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒 含有密碼子優(yōu)化的N1NA、H5HA和H9HA基因的質(zhì)粒，由北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司提供；真核表達(dá)載體pCAGGS-IRES載體由上海獸醫(yī)研究所動物流感病毒病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存（圖1）；DH5α宿主菌購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

圖1　pCAGGs-IRES簡明載體圖Fig. 1 The simple vector map of pCAGGs-IRES

1.2引物的設(shè)計(jì)合成 用軟件Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)所有引物，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成，基因擴(kuò)增引物序列見表1。

表1　基因擴(kuò)增引物Table 1 The premiers for amplifi cation

1.3一抗和二抗 H5HA與H9HA一抗由上海獸醫(yī)研究所動物流感病毒病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；N1NA一抗購自GeneTex公司；辣根標(biāo)記的二抗兔抗雞IgG、羊抗鼠IgG購自Sigma公司。

1.4表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-H5HANA-H9HA的構(gòu)建

1.4.1質(zhì)粒pCAGGS-N1NA的構(gòu)建 首先對擴(kuò)增引物GD-NA-1424-F進(jìn)行磷酸化，然后以密碼子優(yōu)化的基因N1NA質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增NA基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Bgl II酶進(jìn)行酶切處理，同時(shí)pCAGGSIRES載體用Bgl II酶和Msc I酶進(jìn)行酶切后與處理好的NA片段進(jìn)行連接，使NA基因置于β-acting啟動子之下，將構(gòu)建好的載體命名為pCAGGS-N1NA。

1.4.2質(zhì)粒pCAGGS-H5HANA的構(gòu)建 以密碼子優(yōu)化的H5HA質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增HA基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoR I酶和Xho I酶進(jìn)行雙酶切處理。pCAGGS-N1NA載體用EcoR I酶和Xho I酶進(jìn)行雙酶切后，與處理好的HA片段進(jìn)行連接，使HA基因置于β-acting啟動子之下，將構(gòu)建好的載體命名為pCAGGS-H5HANA。

1.4.3表達(dá)HA、NA蛋白質(zhì)粒pCAGGS-H5HANAH9HA的構(gòu)建 以密碼子優(yōu)化H9HA質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增HA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用Nhe I酶進(jìn)行酶切處理。pCAGGS-H5HANA載體用Nhe I酶進(jìn)行酶切后與相同酶處理的HA片段進(jìn)行連接，使HA基因置于SV40啟動子之下，并將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒命名為pCAGGS-H5HANA-H9HA。

1.5間接免疫熒光檢測（indirect immunofl urescence analysis，IFA）HA、NA基因的表達(dá) 將MDCK傳于6孔板中，密度達(dá)到70%左右時(shí)，按照脂質(zhì)體Mirus說明，以2 μg的pCAGGS-H5HANA-H9HA質(zhì)粒量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次；用0.5%Triton浸透5 min，PBS漂洗3次；加1%BSA 37℃封閉1 h，PBS漂洗3次；然后在相應(yīng)的孔中分別加入稀釋200倍的H5的HA一抗、H9的HA一抗、H5N1的NA一抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗3次；分別對應(yīng)加入1:1000稀釋的辣根標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗、辣根標(biāo)記兔抗雞二抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗3遍，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6血凝實(shí)驗(yàn)檢測病毒樣顆粒包裝 轉(zhuǎn)染前24 h將293T細(xì)胞傳于 6 孔板，待其密度達(dá)到約 80%以上，將構(gòu)建好的質(zhì)粒pCAGGS-H5HANA-H9HA以 2 μg/孔，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)染于 293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 48 h 后，取 50 μL 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，在血凝板上用PBS 進(jìn)行2 倍倍比稀釋，然后加入等體積的 0.5% 雞紅細(xì)胞，室溫靜置 20～30 min，觀察血凝結(jié)果。

1.7透射電子顯微鏡觀察病毒樣顆粒形 轉(zhuǎn)染前 24 h 將 293T 細(xì)胞傳代于2個(gè)100 mm×20 mm的大培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到 70%，按脂質(zhì)體Mirus說明書操作，將質(zhì)粒GD-HA-GD-NA-441-HAPCAGGS-H5HANA-H9HA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染量為 10 μg/皿，轉(zhuǎn)染后 6 h 換正常培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿補(bǔ)充約 20 mL 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞上清，4℃、3000×g（水平轉(zhuǎn)子）離心30 min，收集上清，然后將上清于4℃、10 000×g 離心1 h，以上兩步操作能去除細(xì)胞脆片及雜質(zhì)。將收集到的細(xì)胞上清置于超速離心機(jī)，4℃、60 000×g 離心4 h。離心后輕輕棄去上清，用 1 mL STE溶液重懸沉淀物并混勻。將得到的沉淀物懸濁液進(jìn)行蔗糖梯度離心，在離心管中由下至上依次加入60%、30%和15%的蔗糖溶液，最上方加入沉淀物懸濁液，4℃、60 000×g離心4 h。吸取純化后的病毒層用STE緩沖液稀釋，3000×g超速離心后用1 mL PBS溶解，得到最終的病毒純化液。取50 μL進(jìn)行血凝效價(jià)的測定，剩余的樣品稀釋固定于銅網(wǎng)上，用磷鎢酸復(fù)染，通過透射電子顯微鏡（日本 GEM2100）觀察。

2　結(jié)果

2.1表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-H5HANA-H9HA的構(gòu)建 凝膠電泳結(jié)果顯示有3條大小不同的特異性片段，大小分別為1.4、1.7、1.7 kb。經(jīng)測序鑒定序列正確，表明N1NA、H5HA和H9HA片段已經(jīng)成功插入到pCAGGS質(zhì)粒載體相對應(yīng)的位點(diǎn)，即pCAGGSH5HANA-H9HA構(gòu)建成功。

2.2IFA HA與NA的表達(dá) 將表達(dá)質(zhì)粒pCAGGSH5HANA-H9HA轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，可觀察到N1NA、H5HA和H9HA蛋白的表達(dá)（圖2）。

2.3血凝試驗(yàn)初步鑒定病毒樣顆粒的包裝 以 2 μg/孔的質(zhì)粒濃度轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，48 h之后檢測血凝效價(jià)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-H5HANAH9HA出現(xiàn)血凝效價(jià)，效價(jià)最高可以達(dá)到 24。

2.4透射電子顯微鏡觀察病毒樣顆粒 經(jīng)蔗糖純化超速離心后，進(jìn)行血凝效價(jià)的測定，同時(shí)表達(dá)N1NA、H5HA和H9HA蛋白的血凝效價(jià)達(dá)到28。將樣品處理后置于透射電子顯微鏡下觀察，可觀察到病毒樣顆粒的形態(tài)（圖3）。病毒樣顆粒呈圓形、橢圓形等不規(guī)則形態(tài)，中心空洞但邊緣致密呈空殼狀。

圖2　PCAGGS-H5HANA-H9HA重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測Fig. 2 Detection of N1NA， H5HA， H9HA expression in MDCK cells transfected with pCAGGS-H5HANA-H9HA plasmid by IFA

圖3　病毒樣顆粒形態(tài)Fig. 3 Morphology of virus like particle（VLP）

3　討論

真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-IRES載體上有SV40啟動子、雞的β-actin啟動子和CMV增強(qiáng)子，將密碼子優(yōu)化的基因H5HAH5NAH9HA片段克隆到質(zhì)粒載體pCAGGS-IRES上的對應(yīng)位置。通過IFA顯示插入到真核表達(dá)載體上的3個(gè)基因片段分別表達(dá)相對應(yīng)的蛋白。將表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-H5HANA-H9HA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過血凝實(shí)驗(yàn)證明存在血凝效價(jià)，并且在48 h后達(dá)到最高值24，說明轉(zhuǎn)染后存在血凝活性。將收集到的293T細(xì)胞上清進(jìn)行高離、超離以及蔗糖梯度離心純化后，在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有明顯的病毒樣顆粒，這也驗(yàn)證了插入HA和NA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒能有效的表達(dá)病毒樣顆粒，表明HA和NA結(jié)構(gòu)蛋白在病毒樣顆粒的包裝與釋放中起著重要的作用，很多文獻(xiàn)報(bào)道也證實(shí)了這一結(jié)論［1，22-25］。之前研究對于病毒樣顆粒包裝與釋放的主要結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)論不一，主要是由于包裝系統(tǒng)不同或者是不同亞型的病毒結(jié)構(gòu)蛋白存在差異，這需要進(jìn)一步的探索和研究。

本研究采用的真核表達(dá)系統(tǒng)包裝病毒樣顆粒的方法簡單易于操作，同時(shí)存在多個(gè)克隆位點(diǎn)，為流感病毒的生物學(xué)特性研究提供了有力的工具。同時(shí)，由于病毒樣顆粒具有很強(qiáng)的免疫原性和生物活性，并且不具有感染性，采用真核表達(dá)系統(tǒng)包裝病毒樣顆粒在流感病毒疫苗的研究方面具有很好的應(yīng)用前景。

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CONSTRUCTION OF THE PLASMID EXPRESSING H5/H9 HEMAGGLUTININ SUBTYPES OF AND N1 NEURAMINIDASE OF AVIAN INFLUENZA VIRUS

YU Zhou-lu， TENG Qiao-yang， CUI Hong-rui， RONG Guang-yu， LI Xue-song， YANG Jian-mei，CHEN Hong-jun， LI Ze-jun

（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China）

The DNA vaccine is one of the most promising novel vaccines against animal infl uenza. In the present study， the eukaryotic expressing plasmid that co-expressed H5HA， H9HA and N1NA was constructed. All proteins of H5HA， H9HA and N1NA were detected in indirect immunofl uorescence analysis （IFA） on the transfected MDCK cells. In the supernatants of the transfected 293T cells， HA titer were 24and the virus like particles （VLPs） were detected under electron microscope. The proteins from different subtypes of infl uenza were co-expressed by one plasmid and formed VLPs， which provided sold fourdation for development of the polyvalent DNA vaccines against infl uenza.

Avian infl uenza； virus like particles； H5HA； H9HA； N1NA

S852.659.5

A

1674-6422（2016）04-0013-06

2016-12-22

自然科學(xué)基金（面上）項(xiàng)目（31472206）

于周璐，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李澤君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn