孟 瓊，孔 寧，單同領(lǐng)，吳永光，左葉雯，童 武，鄭 浩，李國新，于 海，童光志，徐永杰

（1. 信陽師范學(xué)院，信陽 464000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

豬流行性腹瀉病毒間接ELISA檢測(cè)方法的建立

孟 瓊1，2，孔 寧2，單同領(lǐng)2，吳永光2，左葉雯2，童 武2，鄭 浩2，李國新2，于 海2，童光志2，徐永杰1

（1. 信陽師范學(xué)院，信陽 464000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

本研究獲得5個(gè)豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）S1基因截短基因，原核表達(dá)后制備多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、Western blot 和間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immunofl uorescence assay，IFA）顯示，僅有SE蛋白誘導(dǎo)的多克隆抗體具有免疫活性。因此以SE蛋白為抗原建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，優(yōu)化各反應(yīng)參數(shù)并確定臨界值為0.155。經(jīng)特異性和符合性分析，該ELISA檢測(cè)方法具有PEDV特異性，符合率為93.7%。批內(nèi)、批間重復(fù)率變異系數(shù)均小于10%，表明建立的iELISA方法重復(fù)性良好?？筍蛋白的ELISA檢測(cè)方法的建立為PEDV血清學(xué)抗體檢測(cè)和疫苗評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。

間接ELISA；豬流行性腹瀉病毒；截短S蛋白

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和哺乳仔豬高致死率為主要特征［1］。自2010年以來，PED以仔豬高病發(fā)率和死亡率給中國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，是當(dāng)前仔豬腹瀉死亡的重要病因之一［2］。因此，PEDV診斷技術(shù)的研究具有重要的意義。

PEDV為冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）中 I 群成員［3］。S蛋白是冠狀病毒屬成員最重要的一個(gè)表面囊膜糖蛋白，形成病毒粒子表面特征性的冠狀結(jié)構(gòu)。比較S蛋白S1和S2亞基之間GxCx及保守九聚體同源性，S蛋白被劃分為S1（第1～789位氨基酸）和S2（第790～1383位氨基酸）兩個(gè)功能區(qū)［4］，其中S1區(qū)包含多個(gè)病毒主要中和表位和受體結(jié)合域［5］。

Ren等［6］利用PEDV M 蛋白的單克隆抗體建立了競(jìng)爭(zhēng)阻斷ELISA診斷方法。Hou等［7］利用PEDV重組N蛋白抗原建立了間接ELISA方法。Oh等［8］用病毒全蛋白為包被抗原建立了ELISA方法，該方法與中和試驗(yàn)符合率達(dá)到84.2%。本研究以S1蛋白作為靶蛋白，將其分為5個(gè)相互重疊的片段，通過原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)各截短蛋白，制備多克隆抗體，確定S1免疫活性區(qū)，并以PEDV S1區(qū)具有免疫活性的SE蛋白（666～789 aa）為抗原建立了間接ELISA檢測(cè)方法。

1　材料和方法

1.1病毒、細(xì)胞及血清 PEDV強(qiáng)毒株JS-2013由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存（JS-2013為PEDV變異株，從江蘇省某豬場(chǎng)爆發(fā)變異PEDV的1～5日齡腹瀉仔豬的小腸和內(nèi)容物中分離得到）；Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）及PEDV陰陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑及試劑盒 pCold TF表達(dá)載體和BL21 （DE3）宿主菌為本試驗(yàn)室保存；BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、In-Fusion HD Cloning Kit 均購自TaKaRa公司；蛋白定量試劑盒PierceTMBCA Protein Assay Kit購自Thermo公司；6周齡雌性BALB/c鼠購自上海靈暢生物科技有限公司；弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、HT 混合鹽、HAT 混合鹽和HRP 標(biāo)記羊抗鼠IgG 、FITC羊抗鼠IgG均購自Sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco公司；Nickel magnetic beads for protein purification蛋白純化試劑盒購自Biotool公司。

1.3蛋白的原核表達(dá)與純化 通過DNAStar軟件分析，將S1基因截短為5個(gè)相互重疊的基因片段SA、SB、SC、SD和SE，以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的包含S1基因的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序正確的目的片段與表達(dá)載體pCold TF經(jīng)BamHⅠ酶切，連接轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)中，陽性菌液經(jīng)0.5%IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，使用Nickel magnetic beads for protein purification蛋白純化試劑盒純化表達(dá)的各目的蛋白，并用PierceTMBCA protein assay kit蛋白定量試劑盒測(cè)定其濃度，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4多克隆抗體的制備與特異性鑒定

1.4.1多克隆抗體的制備 以純化的SA、SB、SC、SD和SE重組蛋白為抗原，分別對(duì)6周齡雌性BALB/ c小鼠進(jìn)行注射免疫。初次免疫，重組蛋白抗原0.5 mg/mL與等量弗式完全佐劑乳化混合，腹部皮下多點(diǎn)注射200 μL；此后每2周免疫1次，加等量弗氏不完全佐劑；三免后，小鼠眼球采血，分離血清于-20℃保存。

1.4.2多克隆抗體效價(jià)測(cè)定 以純化的SA、SB、SC、SD和SE重組蛋白為抗原分別包被ELISA板，以對(duì)照組小鼠血清為陰性對(duì)照，通過間接ELISA檢測(cè)方法測(cè)定三免后小鼠的抗體效價(jià)水平，并結(jié)合Western blot與間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA）檢測(cè)方法，鑒定免疫小鼠血清的免疫原性。

1.5間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.5.1間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 用方陣滴定法確定ELISA各個(gè)試驗(yàn)條件。陽性血清OD450（P）與陰性血清OD450（N）的比值（P/N值）最大孔所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為最佳反應(yīng)條件。具體的試驗(yàn)步驟按常規(guī)的ELISA程序進(jìn)行［7］。

1.5.2間接ELISA檢測(cè)方法臨界值的確立 根據(jù)優(yōu)化的ELISA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室已知背景的PEDV陰性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算檢測(cè)樣品的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）［9］。

1.5.3特異性、符合率分析 在相同條件下對(duì)PRV和TGEV陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置PEDV的陰陽性血清對(duì)照。用優(yōu)化的間接ELISA檢測(cè)已知背景的豬血清，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算間接ELISA抗體檢測(cè)方法的符合率?？偡下剩?00%）=［（陽性數(shù)+陰性數(shù)）/檢測(cè)總數(shù)］×100%

1.5.4間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：從同批次包被酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取3塊，檢測(cè)已知背景的豬血清樣品6份，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。批間重復(fù)試驗(yàn)：用3塊不同批次包被的酶標(biāo)板同時(shí)檢測(cè)上述血清樣品，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算批間變異系數(shù)［9］。

2　結(jié)果

2.1基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 截短的5個(gè)片段SA、SB、SC、SD、SE基因大小分別為609、573、654、630、369 bp。運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)各基因引物（表1）。測(cè)序正確的pCold TF-SA～SE重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切后，可見約5700 bp的載體片段和400～600 bp目的基因片段，大小與預(yù)期相符（圖1）。

表1　SA、SB、SC、SD和SE基因引物Table 1 Primers for SA， SB， SC， SD and SE gene

圖1　SA、SB、SC、SD和SE重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定Fig. 1 Enzyme-digested products of the fragments SA，SB， SC， SD and SE

2.2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化 測(cè)序正確的pCold TFSA～SE菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h后，取菌體超聲破碎，收集上清，純化表達(dá)的各目的蛋白。將純化后的SA、SB、SC、SD和SE蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)（圖2）。

2.3多克隆抗體效價(jià)測(cè)定 取三免后的小鼠血清進(jìn)行ELISA抗體效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果表明SA、SB、SC和 SD組的抗體效價(jià)均低于1.0×103，而SE組抗體水平達(dá)到1.0×105，表明SE蛋白具有較好的免疫原性（圖3）。

PEDV感染Vero細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中的S蛋白（圖4），IFA檢測(cè)Vero細(xì)胞中的病毒（圖5）。結(jié)果顯示，SE組的小鼠血清中的多克隆抗體具有免疫原性。

2.4間接ELISA的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化 確定以SE蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法，運(yùn)用方陣滴定法確定并優(yōu)化了ELISA檢測(cè)方法的條件。將純化好的SE蛋白用碳酸鹽溶液包被，包被濃度為100 ng/孔，37℃孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；5% SMP封閉 200 μL/孔，常溫孵育1.5 h，PBST洗滌（方法同上）；一抗1:50稀釋常溫孵育1 h，PBST洗滌；二抗1:10 000稀釋后，37℃孵育30 min，PBST洗滌；50 μL/孔TMB顯色，常溫顯色15 min，加硫酸終止液50 μL/孔終止反應(yīng)，OD450值測(cè)定。

2.5間接ELISA臨界值的確立 選取實(shí)驗(yàn)室已知背景的32份PEDV陰性血清樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：平均值為0.100，標(biāo)準(zhǔn)差為0.018。按照間接ELISA臨界值標(biāo)準(zhǔn)，該檢測(cè)方法的臨界值如下：當(dāng)OD450≥X+3SD=0.155時(shí)，可判定為陽性；OD450≤X+2SD=0.137時(shí)，可判定為陰性；介于兩者之間為可疑血清（表2）。

圖2　SA、SB、SC、SD和SE蛋白純化結(jié)果Fig. 2 Purifi cation of proteins SA， SB， SC， SD and SE

圖3　SA、SB、SC、SD、SE蛋白多克隆抗體效價(jià)Fig. 3 Titer of polyclonal antibody to SA， SB， SC， SD， SE protein

圖4　多克隆抗體的Western blot鑒定Fig. 4 Western blot analysis of polyclonal antiserum

圖5　PEDV感染Vero細(xì)胞的間接免疫熒光檢測(cè)Fig. 5 Immunofl uorescence analysis of PEDV in Vero cell

表2　32份PEDV陰性血清的ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 2 ELISA results of 32 PEDV negative serum samples

2.6特異性及符合性試驗(yàn)結(jié)果 利用建立的間接ELISA方法對(duì)PRV、TGEV及PEDV陰陽性豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示TGEV、PRV感染豬的陽性血清OD450值均小于0.137，為PEDV陰性，表明該間接ELISA方法具有較好的特異性。

用已經(jīng)建立的間接ELISA方法對(duì)64份已知背景的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽性樣品32份均檢測(cè)為陽性，陰性樣品32份中28份為陰性，4份為可疑，計(jì)算符合率結(jié)果為93.7%。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)為1.4%～8.3%（表3），批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為2.1%～7.8%（表4），均未超過10%，表明該間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表3　批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of intra-assay repeat tests

表4　批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of inter-assay repeat tests

3　討論

目前，病毒中和試驗(yàn)是使用最廣泛的PEDV抗體血清學(xué)檢測(cè)方法，在疫苗接種后能高效特異性的測(cè)定抗體效價(jià)，但是該檢測(cè)方法十分昂貴且操作復(fù)雜耗時(shí)。ELISA用于大分子抗原和特異性抗體檢測(cè)，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床應(yīng)用。早期的間接ELISA方法選取的包被抗原為Vero細(xì)胞分離出的全病毒或細(xì)胞表達(dá)的病毒蛋白。由于免疫動(dòng)物血清中含有細(xì)胞培養(yǎng)的PEDV，可能與細(xì)胞表達(dá)的ELISA包被抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致特異性低、背景高。因此，本研究采用原核表達(dá)的方法制備間接ELISA包被抗原，避免了細(xì)胞源的交叉反應(yīng)。

PEDV是囊膜病毒，表面的囊膜糖蛋白在病毒侵入宿主細(xì)胞以及感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮決定性作用［3］。PEDV S蛋白的S1區(qū)包含病毒主要的中和抗原表位和受體結(jié)合域［10］。為精確定位間接ELISA包被抗原，本研究根據(jù)氨基酸的親疏水性將S1區(qū)截短為SA（第1～340位氨基酸）、SB（第167～357位氨基酸）、SC（第321～789位氨基酸）、SD（第504～789位氨基酸）和SE（第666～789位氨基酸）5個(gè)片段，分別進(jìn)行原核表達(dá)并制備多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA、Western blot及IFA檢測(cè)對(duì)多抗特異性的篩選，確定了具有免疫活性的SE （666～789 aa）蛋白為抗原建立間接ELISA檢測(cè)方法。通過對(duì)32份已知PEDV陰性血清的檢測(cè)，確定了陰陽性臨界值，為樣品陰陽性判斷提供依據(jù)。經(jīng)特異性、符合率及重復(fù)率分析，表明本研究建立的ELISA方法具有較高的特異性和穩(wěn)定性。

SE蛋白由123個(gè)氨基酸組成，位于S1D區(qū)（636～789 aa），該區(qū)在PEDV S蛋白S1區(qū)高度保守，且是中和表位區(qū)［11］，因此，作為ELISA包被抗原，SE蛋白能更特異和準(zhǔn)確與血清中的PEDV S蛋白多克隆抗體結(jié)合。本研究建立的間接ELISA方法為血清學(xué)抗體檢測(cè)和流行病學(xué)研究、S1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究、抗原表位的鑒定及新型免疫學(xué)檢測(cè)方法的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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DEVELOPMENT OF AN INDIRECT ELISA OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS

MENG Qiong1，2， KONG Ning2， SHAN Tong-ling2， WU Yong-guang2， ZUO Ye-wen2， TONG Wu2，ZHENG Hao2， LI Guo-xin2， YU Hai2， TONG Guang-zhi2， XU Yong-jie1

（1. Xinyang Normal University， Xinyang 464000， China； 2. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China）

Five overlopping fragments covered the gene S1 of Porcine epidemic diarrhea virus， were separately expressed and be used to prepare the murine polyclonal antibody. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， Western blot and indirect immunofl uorescence assay （IFA） assays showed that the polyclonal antibody induced by SE protein has immune activity. Therefore， we developed an indirect enzyme-linked immunosorbent assay （iELISA） based on the protein SE. The parameters of iELISA were optimized and the cutoff value determined as 0.155. The coincidence rate of iELISA was 93.7%， and the coeffi cients of variation of the intra and inter batch were both less than 10%. In addition the method has a good specifi city of PEDV. The results suggested this iELISA was specifi c， sensitive， and repeatable. Based on iELISA against S protein， it might be easy to detect serological antibody and evaluate the vaccine effi cacy.

Indirect ELISA； Porcine epidemic diarrhea virus； truncated S protein

S852.659.6

A

1674-6422（2016）04-0007-06

2016-03-01

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201915）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2013）第3-6號(hào)，第5-5號(hào)）作者簡(jiǎn)介：孟瓊，女，碩士研究生，動(dòng)物學(xué)專業(yè)

徐永杰，E-mail：yongjx81@126.com；單同領(lǐng)，E-mail：shantongling@shvri.ac.cn