汪 凱，蔡驍垚，葉建強(qiáng)，劉紅梅，張 泉，劉芹防，李澤君，陳鴻軍（. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 004；. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 006；. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 5009）

·研究論文·

新型雞心包炎—包涵體肝炎病毒的分離及鑒定

汪 凱1，2，蔡驍垚1，3，葉建強(qiáng)3，劉紅梅2，張 泉3，劉芹防1，李澤君1，陳鴻軍1
（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；3. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

2015年在江蘇省某養(yǎng)雞場(chǎng)疑似心包炎-包涵體肝炎病死雞肝臟中分離獲得1株病毒，經(jīng)SPF雞胚4代純化，并針對(duì)其hexon基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果表明該分離株屬于I群禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）血清4型，命名為JS7株。ORF29和fiber2基因測(cè)序分析表明，該毒株為最近在國(guó)內(nèi)流行的新型突變株。JS7株以1000 ELD50病毒量肌肉接種21日齡雛雞，5 d內(nèi)呈現(xiàn)80%死亡率，剖檢可見(jiàn)典型的心包炎、肝炎癥狀，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、氣管、法氏囊、腦、小腸、盲腸、腺胃、胸腺、胰臟中均能檢測(cè)到病毒分布；H&E染色結(jié)果顯示，在組織切片中，肝臟呈現(xiàn)典型的嗜堿性核染色，其他組織臟器也呈現(xiàn)不同程度的病理變化?？梢?jiàn)JS7株在雛雞中具有較強(qiáng)的致病性及廣泛的組織嗜性。

包涵體肝炎；禽腺病毒；fi ber2；分離；鑒定

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬腺病毒科，根據(jù)抗原性可分為A～E群。從雞分離的I群FAdV有12個(gè)血清型（FAdV1～12）［1］，是雞、鴨、鵝等禽類(lèi)常見(jiàn)的傳染病病原之一［2］。FAdV感染呈全球流行，可引起非典型病變和亞臨床癥狀，表現(xiàn)為肝炎、再生障礙性貧血、出血、輕度呼吸道疾病和產(chǎn)蛋量下降，嚴(yán)重的可造成雞包涵體肝炎（inclusion body hepatitis in chicken，IBH）、心包炎綜合征（hydropericardium syndrome，HPS）、肌胃糜爛和潰瘍（gizzard erosion and ulceration，GEU）等［3-7］。

2013年，中國(guó)爆發(fā)了一種可引起IBH和HPS的高致病性FAdV感染，主要侵害3～5周齡肉雛雞和10～20周齡蛋雞。至2015年6月，該病在全國(guó)大范圍流行，多呈急性發(fā)病，且多發(fā)生于20～30日齡肉雞，發(fā)病后d 4～8為死亡高峰，病程8～15 d，死亡率為20%～80%，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［8，9］。本研究從疑似心包炎-包涵體肝炎病死雞肝臟病料中分離一種新型病毒，經(jīng)PCR和動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，鑒定出該毒株為I群FAdV血清4型新型變異株，動(dòng)物攻毒試驗(yàn)證實(shí)，該毒株對(duì)雛雞具有強(qiáng)致病力。

1　材料與方法

1.1主要試劑 Phanta?Max Super-Fidelity DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；pGEM-T easy載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2病料和雞胚 2015年8月在江蘇省某疑似心包炎-包涵體肝炎的肉雞群中采集病變肝臟，保存?zhèn)溆?；SPF雞胚及SPF雞購(gòu)于北京梅里亞維通有限公司。

1.3病毒分離與純化 取疑似心包炎-包涵體肝炎的病死雞肝臟作為病料，將組織剪碎，加入鋼珠，用含有2000 IU青霉素和2000 μ g鏈霉素?zé)o菌生理鹽水稀釋?zhuān)诮M織研磨器上震蕩（70 Hz，5 min），8000×g離心10 min，取上清液置室溫作用30 min，取0.2 mL經(jīng)卵黃囊途徑接種7日齡SPF雞胚，收獲接種24 h后死亡雞胚的尿囊液，觀察雞胚肝臟病變。收獲的尿囊液按有限稀釋法再次經(jīng)卵黃囊接種7日齡雞胚，連續(xù)傳3次，進(jìn)行有限稀釋純化。

1.4分離株血凝特性及理化特性 配制1%的雞、小鼠、綿羊或兔紅細(xì)胞，檢測(cè)分離株是否具有凝集紅細(xì)胞的能力。對(duì)病毒尿囊液分別以氯仿、乙醚、鹽酸（pH3）、5-溴尿嘧啶-2-脫氧核苷酸（BUDR）、NaOH（pH10）和60℃處理1 h，接種雞胚死亡情況，觀察7 d，采集雞胚肝臟和尿囊液進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.5PCR鑒定 取上述研磨液或尿囊液0.2 mL，利用上海生工的基因組D N A試劑盒提取總D N A，測(cè)定濃度，-2 0℃凍存?zhèn)溆?。參考GenBank中O N 1毒株hexon基因（登錄號(hào)：GU188428）的852～1518 bp處設(shè)計(jì)特異性引物，F(xiàn)AdV-F1：5'-CAACTACATCGGGTTCAGGGA TAACTTC-3'；FAdV-766R：5'-CCAGTTTCTGT GGTGGTTGAAGGGGTT-3'，擴(kuò)增目的片段為766 bp。用超純水稀釋上述提取的總DNA至50 ng/μL，作為PCR模板。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，回收目的條帶，送蘇州金唯智公司測(cè)序。

1.6ORF29全基因擴(kuò)增及測(cè)序鑒定 參考ON1毒株ORF29序列（登錄號(hào)：GU188428）的全基因設(shè)計(jì)引物。ORF29-F：5'-ATGGTGATTTTCTTCAATC-3'，ORF29-R：5'-TCAATGGATGGGATCCCA-3'，擴(kuò)增目的片段在150～200 bp不等。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，回收目的條帶，連接至pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑，PCR鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送蘇州金唯智公司測(cè)序。

1.7fiber2全基因擴(kuò)增及序列比對(duì) 根據(jù)GenBank已公布的f i b e r2全基因設(shè)計(jì)引物（登錄號(hào): GU188428），以病毒總DNA為模板擴(kuò)增，fiber2全基因?yàn)?425 bp，其引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。fiber2序列如下，F(xiàn)AdV-F2-1F：5'-AAGGGGTACCATGCTCCGAGCCCCT-3'（下劃線為Kpn I酶切位點(diǎn)）；FAdV-F2-1425R：5'-CCCAAGCTTTTACGGGACGGAGGCCG-3'（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)）。使用基因組DNA提取試劑盒對(duì)收獲的病毒進(jìn)行DNA提取，擴(kuò)增fiber2全基因片段，回收純化PCR產(chǎn)物，并連接到pGEM-T easy載體，PCR鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送蘇州金唯智公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與其他腺病毒fiber2全基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比。

1.8病毒含量測(cè)定 取傳代第三次的雞胚尿囊液進(jìn)行有限稀釋?zhuān)腰S囊接種7日齡雞胚，放置37℃溫箱中，每天照胚2次，記錄胚死亡時(shí)間。在接種后d 7，對(duì)未致死的雞胚各收獲200 μL尿囊液，分別提取DNA，應(yīng)用PCR方法鑒定hexon基因。根據(jù)Reed-Muench方法分別計(jì)算病毒含量，以半數(shù)雞胚致死量（ELD50/mL）計(jì)算。

1.9動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 用無(wú)菌PBS稀釋純化的JS7病毒至103ELD50/100μL，經(jīng)胸部肌肉注射3周齡SPF雞，之后置于正壓隔離器中，觀察14 d，記錄攻毒組發(fā)病情況和致死率。取病死雞的心臟、肝臟、腦、脾臟、肺臟、腎臟、胰臟、法氏囊、十二指腸、盲腸、胸腺等組織，分別稱取100μg組織樣品，利用上海生工DNA試劑盒提取病毒基因組DNA，PCR方法鑒定hexon基因，確定病毒在雞體內(nèi)的分布；另取1份組織用10%中性福爾馬林固定，制作H&E切片，觀察各臟器病變。

2　結(jié)果

2.1雞胚分離結(jié)果 將疑似心包炎-包涵體肝炎發(fā)病雞群中的肝臟樣品經(jīng)RT-PCR和PCR鑒定，排除禽流感、新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征、雞傳染性貧血、馬立克氏病、雞傳染性支氣管炎等病毒感染，僅hexon基因PCR為陽(yáng)性，條帶大小為766 bp（圖1）。經(jīng)測(cè)序證明，該分離株為I群腺病毒（FAdV）血清4型，命名為JS7株。

圖1　hexon基因PCR結(jié)果Fig. 1 Amplifi cation of hexon gene by PCR

分離株經(jīng)60℃和BUDR、NaOH（pH10）處理1 h后，接種雞胚，雞胚無(wú)死亡，正常發(fā)育，肝臟DNA檢測(cè)PCR為陰性，表明分離株核酸類(lèi)型為DNA，病毒不耐堿，對(duì)熱敏感，60℃ 1 h可滅活病毒。然而，經(jīng)乙醚、氯仿和鹽酸（pH3）處理的毒株，不影響病毒在雞胚中的增殖，出現(xiàn)雞胚死亡，肝臟明顯病變，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性。這表明該分離株無(wú)脂質(zhì)囊膜，耐酸，對(duì)乙醚和氯仿有抵抗力。

將該病料接種SPF雞胚，d5出現(xiàn)死亡，d6～7死亡達(dá)到高峰。死亡雞胚的胚體與正常雞胚相比，顯得瘦小、發(fā)育不良、體表潮紅，胚體有大量出血點(diǎn)；絨毛尿囊膜有不同程度地增厚，呈灰白色云霧狀；雞胚肝臟出血，有的肝臟呈黃褐色，表面有壞死灶（圖2）。

圖2　雞胚死亡及病變結(jié)果Fig. 2 The challenge results in embryonated SPF eggs

2.2ORF29基因序列比對(duì) 與2013年國(guó)內(nèi)分離的強(qiáng)毒株JSJ13株相比，JS7分離株ORF29基因有33 nt的缺失，該段缺失與經(jīng)典毒株ON1毒株相同（圖3）。

2.3fiber2全序列比對(duì)分析 對(duì)經(jīng)尿囊液純化的病毒提取DNA，PCR擴(kuò)增fiber2基因，對(duì)該基因進(jìn)行測(cè)序，將序列與GenBank中登錄的部分同源序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因與I群禽腺病毒C亞群血清4型同源性較高，再次證明該分離株屬于FAdV-C血清4型。利用Mega6軟件繪制fiber2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，由圖4可見(jiàn)，F(xiàn)AdV-C血清4型病毒的fiber2基因可分為2個(gè)分支，與JSJ3相似的是，該分離株位于Group II分支上（圖4）。

2.4動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 取經(jīng)4次傳代純化的雞胚尿囊液，病毒滴定結(jié)果顯示，效價(jià)為1.58×105ELD50/mL。將該病毒稀釋成1×103ELD50/100μL，經(jīng)胸肌注射5只3周齡SPF雞，在攻毒后d 3，所有雞均開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為精神萎靡，羽毛蓬亂無(wú)光澤，白色水樣下痢。4～7 d內(nèi)，4只死亡，1只康復(fù)。對(duì)4只病死雞進(jìn)行剖檢，結(jié)果可見(jiàn)，所有病死雞肝臟質(zhì)脆、腫大；心包積有淡黃色清亮透明滲出液；脾臟發(fā)黑，出血嚴(yán)重；腺胃粘膜脫落、糜爛；十二指腸粘膜脫落、出血；盲腸出血嚴(yán)重，腎臟腫大、出血。部分肝臟呈現(xiàn)土黃色，表面有出血斑或出血點(diǎn)（圖5）。

2.5PCR檢測(cè)組織臟器分布 采集病死雞的臟器組織，提取基因組DNA，經(jīng)hexon特異性PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該毒株在雛雞體內(nèi)分布廣泛，能侵染雛雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、氣管、法氏囊、腦、十二指腸、盲腸、腺胃、胸腺、胰臟等內(nèi)臟器官（圖6）。

2.6肝臟組織病理變化 對(duì)正常雞和病死雞肝臟組織分別進(jìn)行固定、包埋、切片、H&E染色，在顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，正常雞肝臟細(xì)胞紋理清晰，核致密，分布均勻；病死雞的肝臟組織無(wú)正常紋理，核濃染，大量肝細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)典型的嗜堿性包涵體（圖7）。肺臟、腎臟、脾臟、腺胃等其他組織臟器也有程度不同的病變（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖3　FAdV JS7株與其他毒株的ORF29基因序列對(duì)比結(jié)果Fig. 3 The alignment of ORF29 gene between JS7 and other FAdV strains

圖4　基于FAdV血清4型fi ber2基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree based on the fi ber2 gene sequence of serotype 4 FAdV

圖5　JS7分離株感染SPF雞產(chǎn)生的心包炎-包涵體肝炎病變Fig. 5 The lesions of hydropericardium-hepatitis syndrome in chickens infected with JS7

圖6　JS7分離株感染SPF雞后各組織臟器的PCR鑒定結(jié)果Fig. 6 Amplifi cation of hexon gene from the tissue samples

圖7　JS7分離株感染SPF雞后肝臟組織的病理變化Fig. 7 Hisopathological changes in the liver of SPF chickens infected with strain JS7

3　討論

I群禽腺病毒共有12個(gè)血清型，能引發(fā)雞包涵體肝炎的多見(jiàn)于血清1～5、7、8、10型。不同血清型對(duì)禽類(lèi)的致病性各不相同［8-11］。一直以來(lái)，禽腺病毒被認(rèn)為是一種條件性致病病毒，并不能單獨(dú)引起包涵體肝炎和心包炎癥狀。然而，自2013年以來(lái)，尤其是2015年夏秋季，國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞場(chǎng)出現(xiàn)大量類(lèi)似病例［5］。

本研究從江蘇省某養(yǎng)雞場(chǎng)分離獲得1株可導(dǎo)致雞心包炎-包涵體肝炎癥狀的新型禽腺病毒，該分離株不具備凝集雞、鴨、鼠、兔、綿羊紅細(xì)胞的能力，耐酸、不耐堿，對(duì)熱敏感，基本特征符合禽腺病毒的生物學(xué)特性。隨后，經(jīng)雞胚卵黃囊接種增殖和純化該病毒，能夠造成雞胚停止發(fā)育、出血、死亡，引發(fā)明顯的雞胚肝臟損傷，出現(xiàn)黃白色壞死或明顯出血癥狀。對(duì)其中3種基因（hexon、ORF29和fiber2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)比GenBank已經(jīng)登錄的I群禽腺病毒相關(guān)序列，鑒定出該病毒為I群禽腺病毒血清4型分離株。

通過(guò)比對(duì)fiber2基因全長(zhǎng)序列，該分離株與最近在國(guó)內(nèi)流行的強(qiáng)毒株均屬于一個(gè)簇（Group II）中。ORF29基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該分離株與最近流行的國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株不一致，而與早期分離的ON1毒株缺失位置完全相同。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示完全復(fù)制出臨床上的包涵體肝炎、心包炎等癥狀，且病毒在組織臟器中分布廣泛，致死率為80%，發(fā)病率為100%。這些生物學(xué)特性及分子生物學(xué)特征表明，該分離株為I群禽腺病毒血清4型新型變異株，這一結(jié)果為下一步研制新型疫苗，并用于診斷和防控該病蔓延發(fā)揮了重要的作用。

［1］ 殷震， 劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)［M］. 2版. 北京: 科學(xué)出版社，1997.

［2］ Choi K S， Kye S J， Kim J Y， et al. Epidemiological investigation of outbreaks of fowl adenovirus infection in commercial chickens in Korea［J］. Poult Sci， 2012， 91（10）: 2502-2506.

［3］ Reece R L， Barr D A， Grix D C. Pathogenicity studieswith a strain of fowl adenovirus serotype 8 （VRI-33） in chickens［J］. Aust Vet J， 1987， 64（12）: 365-367.

［4］ Okuda Y， Ono M， Yazawa S， et al. Experimental infection of specific-pathogen-free chickens with serotype-1 fowl adenovirus isolated from a broiler chicken with gizzard erosions［J］. Avian Dis， 2001， 45（1）: 19-25.

［5］ Grgic H， Yang D H， Nagy E. Pathogenicity and complete genome sequence of a fowl adenovirus serotype 8 isolate［J］. Virus Res， 2011， 156（1-2）: 91-97.

［6］ Asthana M， Chandra R， Kumar R. Hydropericardium syndrome: current state and future developments［J］. Arch Virol， 2013， 158（5）: 921-931.

［7］ Zhao J， Zhong Q， Zhao Y， et al. Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in China［J］. PLoS One， 2015， 10（7）: e0133073.

［8］ Ye J， Liang G， Zhang J， et al. Outbreaks of serotype 4 fowl adenovirus with novel genotype， China［J］. Emerg Microbes Infect， 2016， （5）: e50.

［9］ 袁萬(wàn)哲， 李玉保， 王建昌， 等. 雞心包積液-肝炎綜合征的初步研究［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2016， 46（2）: 157-160.

［10］ 國(guó)紀(jì)壘， 刁有祥， 薛耳兌， 等. I群腺病毒山東株的分離鑒定及hexon基因的克隆與分析［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2012，32（12）: 1773-1774.

［11］ 國(guó)紀(jì)壘， 刁有祥， 程彥麗， 等. I群禽腺病毒血清10型的致病性［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2013， 33（8）: 1179-1183.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF GROUP I FOWL ADENOVIRUS SEROTYPE 4 VARIANT STRAIN OF INCLUSION BODY HEPATITIS VIRUS
IN CHICKENS

WANG Kai1，2， CAI Xiao-yao1，3， YE Jian-qiang3， LIU Hong-mei2， ZHANG Quan3，LIU Qin-fang1， LI Ze-jun1， CHEN Hong-jun1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China； 3. Veterinary Medicine College， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

In this study， a new strain of Fowl adenovirus （FAdV） was isolated in chickens with the lesion of the Hydropericardiumhepatitis syndrome （HHS）， which spread in China and had a great loss in chickens in 2015. The liver samples were collected and the genomic DNAs were extracted and identified by polymerase chain reaction （PCR）. Then， the samples were passaged in 7 days-old specifi c-pathogen-free （SPF） chicken embryonated eggs for four times. By sequencing the specifi c PCR product of hexon fragment， the virus was characterized as FAdV， designated as JS7 strain， which was classifi ed into group I Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV-4）. The analysis of ORF29 and the full length of fi ber2 confi rmed that the isolate was a novel variant strain. To check the pathogenicity of the virus in chickens， 21-days-old SPF chickens were challenged with 1000 ELD50 of strain JS7 intramuscularly. At 5 days-post-challenge （dpc）， it caused 4 out of 5 chickens dead， which showed that the mortality rate had reached 80 %. The samples from heart， liver， spleen，lung， kidney， trachea， bursa， brain， duodenum， colon， glandular stomach， thymus and pancreas were collected and the DNAs were extracted， respectively. All of them were positive by PCR method. The tissues above were fi xed and identifi ed with Hematoxylin& Eosin （H & E） staining. Compared to the slices of normal chickens， a lot of typical basophilic nuclear inclusion bodies were shown in hepatic cells of dead chickens. These data demonstrated that strain JS7 had a high pathogenicity and extensive tissue tropism in chickens.

Inclusion body hepatitis； Fowl adenovirus（FAdV）； fi ber2； isolation； identifi cation

S852.659.1

A

1674-6422（2016）04-0001-06

2016-05-03

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（31572502）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物流感病毒病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)

汪凱，男，學(xué)士，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)

陳鴻軍，E-mail：vetchj@shvri.ac.cn