王玉團(tuán)，許麗麗，徐麗華

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

HPLC-PAD法同時(shí)測(cè)定復(fù)方黃柏液涂劑中9種成分的含量

王玉團(tuán)*，許麗麗，徐麗華

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

目的：建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方黃柏液涂劑中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿和連翹苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%磷酸為流動(dòng)相(梯度洗脫)，流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；PAD檢測(cè)器。結(jié)果：9種成分含量測(cè)定的線性關(guān)系良好，線性范圍和相關(guān)系數(shù)分別為12.37～185.55(r=0.999 9)、38.80～582.06(r=1.000 0)、15.90～238.50(r=0.999 9)、1.52～22.86(r=0.999 8)、48.26～723.87(r=1.000 0)、5.90～88.56(r=0.999 3)、6.58～98.64(r=1.000 0)、9.79～119.58(r=0.999 9)、16.91～253.71 μg·mL-1(r=0.999 9)；平均加樣回收率分別為98.63%、102.57%、101.31%、97.95%、102.59%、98.41%、97.59%、98.77%、101.31%；方法的精密度良好，RSD均小于2.0%(n=6)。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確，可靠，可用于復(fù)方黃柏液涂劑的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法-二級(jí)管陣列檢測(cè)器；復(fù)方黃柏液涂劑；含量測(cè)定

復(fù)方黃柏液涂劑主要由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英和地龍五味藥組成。主要作用是清熱解毒、消腫祛腐。用于瘡瘍潰后傷口感染，屬陽證者。是臨床應(yīng)用較廣泛的治療皮膚潰瘍等疾病的外用制劑?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部，僅收載鹽酸小檗堿和連翹苷兩種成分的含量測(cè)定[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，制劑中還含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C等成分，以上成分均具有較強(qiáng)的抗菌藥理作用，特別是所含綠原酸類成分普遍認(rèn)為具有很好的抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、軍團(tuán)菌等細(xì)菌的作用，其抗菌機(jī)制可能與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)菌體內(nèi)的芳基胺乙酰轉(zhuǎn)移酶有關(guān)[2-5]。研究還發(fā)現(xiàn)，連翹苷抑菌作用并不是很強(qiáng)，而連翹酯苷則有明顯的抗炎、解熱、抗內(nèi)毒素、抗菌和抗病毒等作用，故有必要對(duì)制劑中連翹酯苷A進(jìn)行質(zhì)量控制[6-8]。本文對(duì)復(fù)方黃柏液涂劑中9種成分進(jìn)行含量測(cè)定，旨在為復(fù)方黃柏液涂劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，有利于進(jìn)一步提高復(fù)方黃柏液涂劑的質(zhì)量控制水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀；Waters 2448 PAD檢測(cè)器；METTLER AE240電子天平；超聲波清洗儀(蘇州富怡達(dá)公司)。

1.2 試藥

連翹苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110821-201514，含量以93.5%計(jì))；鹽酸小檗堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201212，含量以86.7%計(jì))；綠原酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-200413)；連翹酯苷A(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111810-201001，含量以94.3%計(jì))；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C(成都普思生物科技有限公司，含量≥98%，批號(hào)分別為ps010603-05，ps010512-05，ps08103102，ps08110401)；鹽酸黃柏堿(四川維克奇生物科技公司，批號(hào)20100410，含量>98%)；復(fù)方黃柏液涂劑(山東漢方制藥有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，采用如下色譜條件，色譜柱：Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0～15 min，5%～25%A，15～70 min，25%～35%A，70～80 min，35%～45%A；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；PAD檢測(cè)器(波長(zhǎng)范圍190～450 nm)。在此色譜條件下各色譜峰峰形較好，與相鄰峰的分離度均大于1.5，符合含量測(cè)定要求，理論板數(shù)以新綠原酸峰計(jì)為6878。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿測(cè)定波長(zhǎng)為325 nm，連翹苷測(cè)定波長(zhǎng)為228 nm，分別進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1。

注：A.混和對(duì)照品(325 nm)；B.混和對(duì)照品(228 nm)；C.供試品(325 nm)；D.供試品(228 nm)；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.鹽酸黃柏堿；5.連翹酯苷A；6.異綠原酸B；7.異綠原酸C；8.鹽酸小檗堿；9.連翹苷。圖1 復(fù)方黃柏液涂劑HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

配制一定濃度的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿和連翹苷對(duì)照品甲醇儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液各1 mL，置50 mL棕色量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為61.85、194.02、79.05、7.62、241.29、29.52、32.88、39.86、84.57 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇4 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)5 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。以對(duì)照品濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 9種成分的回歸方程，相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，9種成分峰面積的RSD分別為1.2%、0.8%、0.2%、0.7%、0.6%、0.2%、1.1%、0.8%、1.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積，9種成分峰面積的RSD在0.2%～1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取復(fù)方黃柏液涂劑6份，每份5 mL，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果9種成分含量的RSD在0.2%～2.1%，表明樣品的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的復(fù)方黃柏液涂劑樣品6份(樣2，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸C、鹽酸小檗堿和連翹苷9種成分質(zhì)量濃度分別為123、388、158、15.2、482、58.5、65.2、79.5、169 μg·mL-1)，每份2.5 mL，各精密加入混合對(duì)照品溶液5 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)5 min，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))

2.9 樣品的含量測(cè)定

按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。9種成分的平均含量見表3。

表3 9種成分的含量測(cè)定結(jié)果 /μg·mL-1

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸C在324～327 nm內(nèi)有最大吸收，連翹酯苷A在328 nm附近有最大吸收，鹽酸小檗堿在264 nm附近有最大吸收，鹽酸黃柏堿在284 nm附近有最大吸收，以上8種成分均在325 nm處具有很強(qiáng)的吸收，與雜質(zhì)能夠完全分離，為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過程，故以上8種成分含量測(cè)定波長(zhǎng)選擇為325 nm。連翹苷在波長(zhǎng)325 nm處無吸收，其最大吸收波長(zhǎng)為228 nm，與雜質(zhì)能夠完全分離，故選擇228 nm作為連翹苷的含量測(cè)定波長(zhǎng)。同時(shí)測(cè)定以上9種成分，僅需要提取兩個(gè)波長(zhǎng)下的色譜圖就可以實(shí)現(xiàn)，且基線更加穩(wěn)定，優(yōu)于不同時(shí)間切換不同測(cè)定波長(zhǎng)方法。

3.2 化學(xué)成分探索

在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，在鹽酸黃柏堿和連翹酯苷A色譜峰之間，存在兩個(gè)較大的色譜峰，經(jīng)進(jìn)一步探索，主要來自處方中連翹，具體成分未知。將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，以更好地探索復(fù)方黃柏液涂劑所含其他化學(xué)成分。

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定復(fù)方黃柏液涂劑中9種成分的含量，明確了制劑中有效成分并計(jì)算出其準(zhǔn)確含量，為臨床準(zhǔn)確、安全、合理用藥提供了參考，也有利于進(jìn)一步提高藥品質(zhì)量控制水平。

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SimultaneousDeterminationofNineEffectiveComponentsinFufangHuangbaiyeTujibyHPLC-PAD

WANG Yutuan*，XuLili，XuLihua

(ShandongInstituteForFoodAndDrugControl，250101，China)

Objective：To establish a method for simultaneous determination of neochlorogenic acid，chlorogenic acid，4-dicaffeoylquinic acid，phellodendrine chloride，forsythoside A，isochlorogenic acid B，isochlorogenicacidc，berberinehydrochlorideand phillyrin in Fufang Huangbaiye Tuji.Methods：HPLC method was adopted，Agilent extend C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)column was used with acetonitrile-0.5% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1，the column temperature was 25 ℃ and the PAD detection was used.Results：A good linearity of the above compounds was obtained with the correlation coefficients ranged from 12.37～185.55(r=0.999 9)，38.80～582.06(r=1.000 0)，15.90～238.50(r=0.999 9)，1.52～22.86(r=0.999 8)，48.26～723.87(r=1.000 0)，5.90～88.56(r=0.999 3)，6.58～98.64 μg/mL(r=1.000 0)，9.79～119.58(r=0.999 9)and 16.91～253.71 μg·mL-1(r=0.999 9)，respectively.The average recoveries were 198.63%，102.57%，101.31%，97.95%，102.59%，98.41%，97.59%，98.77% and 101.31%，respectively.The precisions of the method were good，and the RSDs were less than 2.0%(n=5).Conclusion：The method was accurate and reliable，that it could be used for control the quality of Fufang Huangbaiye Tuji.

HPLC-PAD；Fufang Huangbaiye Tuji；content determination

2016-02-18)

*

王玉團(tuán)，主管藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制與研究；Tel：(0531)81216522，E-mail：wytuan@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.026