張家瑛，潘超美*，蘇家賢，肖辛垣

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006；2.廣東本草源科技有限公司，廣東 梅州 514200)

貢菊不定芽離體誘導增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化△

張家瑛1，潘超美1*，蘇家賢1，肖辛垣2

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006；2.廣東本草源科技有限公司，廣東 梅州 514200)

目的：優(yōu)化貢菊不定芽誘導與增值的培養(yǎng)條件，為建立和完善貢菊離體快繁體系奠定基礎(chǔ)。方法：以貢菊無菌組培苗帶芽莖段為試材，通過單因素、組合、正交試驗等方法探討不同植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽誘導、增值的影響，并對基本培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果：優(yōu)選出適用于不定芽誘導的細胞分裂素為6-BA，本實驗條件下不定芽誘導最佳配方為：MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1或6-BA2.0-1mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；不定芽增值最佳配方為：MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；基本培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為：大量元素MS標準濃度+鐵鹽1.5倍MS標準濃度+蔗糖20 g·L-1+椰子汁30 mL·L-1。結(jié)論：6-BA對不定芽誘導有顯著影響，IBA、NAA對不定芽誘導增殖具有一定調(diào)節(jié)作用；基本培養(yǎng)基的改良優(yōu)化可增強不定芽生長發(fā)育。

貢菊；不定芽誘導與增殖；條件優(yōu)化

菊花來源于菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，是我國傳統(tǒng)常用中藥材(Chrysanthemi Flos)，其味甘、苦，性涼，具有清熱解毒、止血消腫、疏肝明目等功效[1]。貢菊是我國藥菊來源之一，可藥食同源，具有廣闊市場前景。

貢菊常栽培于海拔300～600 m、陽光與空氣濕度適宜、氣溫偏低的地區(qū)[2]。廣東本草源科技有限公司貢菊種植基地位于廣東省梅州市大埔縣東北部的西河鎮(zhèn)，屬亞熱帶季風性氣候。晝夜溫差大，氣候溫和，光照充足，雨量充沛，年平均氣溫21.19 ℃，年降水量維持在1500 mm左右，年日照時數(shù)1661 h[3-6]，是藥菊生長的適宜地區(qū)。公司于2010年引種藥菊，并種植成功，獲得了較好的經(jīng)濟效益。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學潘超美教授和安徽中醫(yī)藥大學藥菊專家王德群教授鑒定確認，該品種為“黃山貢菊”的生態(tài)適應型。

由于貢菊有性生殖敗育，不能結(jié)實，故沒有種子。生產(chǎn)上一直采用分株、扦插、埋根等無性繁殖方法生產(chǎn)種苗，但貢菊有嚴重的連作障礙，加上長期以來種植產(chǎn)區(qū)植株感染病害非常嚴重，造成種質(zhì)嚴重退化和變異。本研究團隊受廣東本草源科技有限公司的委托，通過分離莖尖分生組織細胞和熱處理脫毒離體培養(yǎng)技術(shù)，展開貢菊的脫毒快繁和提純復壯繁殖種苗技術(shù)的研究。經(jīng)過兩年多的反復試驗，已初步獲得離體再生無菌叢芽和幼苗，并為種植基地提供了2萬多株脫毒貢菊種苗。本研究是在本課題前期李露華等[7]工作的基礎(chǔ)上，對貢菊不定芽誘導增殖條件進行了篩選優(yōu)化，旨在完善貢菊離體快繁體系，為貢菊優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及種質(zhì)資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以本實驗室前期誘導處理的脫毒無菌試管苗的帶芽莖段為實驗材料。

1.2 實驗條件

所有實驗所用培養(yǎng)基及實驗操作工具均經(jīng)過高壓滅菌鍋滅菌(溫度121 ℃，滅菌時間16 min)，取出冷卻后使用；實驗材料均在一致環(huán)境條件下(除特別說明外，培養(yǎng)基pH 5.8～6.0，蔗糖20 g，瓊脂6 g，溫度(25±2) ℃、光照時間12 h·d-1，光照強度1600～2000 Lux)進行培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 不同細胞分裂素及質(zhì)量濃度對不定芽誘導的影響 以MS為基本培養(yǎng)基及空白對照，選擇細胞分裂素6-芐氨基嘌呤6-BA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)、激動素KT(0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)、苯基噻二唑基脲TDZ(0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1)進行單因素實驗，重復3次，45 d后進行統(tǒng)計。

1.3.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，在篩選出合適的細胞分裂素后，設(shè)計不同配比的細胞分裂素與生長素組合(表3)，考察不同植物激素組合對不定芽誘導的影響。

1.3.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽增殖的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，按(表1)采用L16(45)設(shè)計三因素四水平的正交試驗，考察不同配比6-BA、IBA、NAA三種植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖的影響。

1.3.4 基本培養(yǎng)基的優(yōu)化 無機營養(yǎng)成分優(yōu)化：分別對基本培養(yǎng)基的大量元素濃度(MS標準大量元素濃度的1/4、l/2、1、3/2)、鐵鹽濃度(MS標準鐵濃度的l/2、1、3/2、2)進行單因素試驗，重復3次，45 d后進行統(tǒng)計。

有機營養(yǎng)成分優(yōu)化：分別對蔗糖濃度(10、20、30、40 g·L-1)、椰子汁(0、20、30、40 mL·L-1)進行單因素試驗，重復3次，45 d后進行統(tǒng)計。天然添加物種類是經(jīng)前期對蘋果汁、香蕉汁、馬鈴薯汁、椰子汁進行預實驗篩選后，確定以椰子汁作為誘導貢菊不定芽增殖的天然添加物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel表格進行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制，采用SPSS17.0及正交設(shè)計助手對數(shù)據(jù)進行分析，采用LSD法進行方差分析。

表1 L16(45)不定芽增殖試驗因素水平表 /mg·L-1

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細胞分裂素及質(zhì)量濃度對不定芽誘導的影響

在貢菊不定芽誘導過程中，細胞分裂素種類及濃度的選擇尤為關(guān)鍵。以不添加激素的MS處理組的誘導率對照，從表1可知，TDZ誘導率較低，且誘導不定芽易變異、出現(xiàn)玻璃化、芽體粘連現(xiàn)象，長勢較差，當質(zhì)量濃度n≥0.5 mg·L-1時抑制外植體分化并導致植株逐漸死亡；KT組處理在0.1～1.0 mg·L-1范圍內(nèi)隨激素濃度的增高誘導率呈下降趨勢，而變異率隨著濃度增高呈升高趨勢，在0.1 mg·L-1時誘導率及芽長勢均優(yōu)于高濃度處理組；6-BA在0.5～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)隨激素濃度的增高誘導率呈上升趨勢，以6-BA 2.0 mg·L-1處理誘導效果最佳。綜合上述結(jié)果可知，在貢菊不定芽誘導培養(yǎng)過程中，不宜添加TDZ，以6-BA(x>1.0 mg·L-1)或KT(x≤0.1 mg·L-1)誘導效果較好。

表2 不同細胞分裂素及質(zhì)量濃度對不定芽誘導的影響

注：+表示芽長勢弱，++表示長勢一般，+++表示長勢較好，++++表示長勢良好；-表示誘導失敗，無長勢。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響

以2.1試驗獲得的初步培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，添加不同配比的細胞分裂素及生長素(表3)。接種6～9 d左右基部開始出現(xiàn)少量愈傷組織，隨后莖段腋芽開始萌動，15 d左右腋芽長出新芽，誘導出的不定芽有單芽也有叢芽。由表可知，在同種生長素種類和濃度的情況下，不同類型細胞分裂素對不定芽的誘導率及增值系數(shù)存在顯著性差異，6-BA作用明顯優(yōu)于KT處理。同種細胞分裂素不同質(zhì)量濃度(B1-B3、B6-B7)條件下，B2、B3誘導率無顯著性差異，但增殖系數(shù)芽高存在顯著性差異，B2較優(yōu)；B6、B7誘導率與增值率均存在顯著性差異，以B7組為佳。參考A4(誘導率80%)，可知加入生長素可降低變異率，對不定芽誘導具有一定調(diào)節(jié)作用。綜合各項指標評價，B2、B7誘導效果最佳，貢菊不定芽誘導條件為：6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1或6-BA2.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響

注：同列數(shù)字后小寫字母表示在P=0.05水平上的顯著性差異。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽增殖的影響

表4-1 不定芽誘導增殖正交試驗結(jié)果及直觀分析表

表4-2 不定芽誘導增殖正交試驗方差分析表

2.4 基本培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 無機營養(yǎng)成分的優(yōu)化 大量元素提供植物生長所需礦質(zhì)營養(yǎng)，滿足植物生理需求。由表5可看出，增殖系數(shù)隨著大量元素濃度升高呈先升后降趨勢，D1長勢較差，不定芽葉片發(fā)黃，植株矮?。籇3長勢最優(yōu)，增殖系數(shù)達到6.28，芽體健壯；而濃度上升到D4時抑制不定芽生長，葉色變黃，增殖系數(shù)下降，與D3差異具有顯著性。

植物主要以鰲合鹽的形式吸收鐵，因此實驗采用EDTA-Fe作鐵源，保證鐵元素的有效性。E1處理誘導的不定芽葉片色黃，增殖系數(shù)居組內(nèi)最低；E2E3組長勢最佳，增殖系數(shù)及芽高均無顯著性差異，但E3組葉色較綠，芽體健壯，品質(zhì)較E2稍高；隨著濃度繼續(xù)升高，增殖系數(shù)下降，葉片由綠變?yōu)辄S綠(E4)。綜合上述實驗結(jié)果，適合貢菊不定芽誘導增殖的無機營養(yǎng)條件為標準MS大量元素濃度及1.5倍MS鐵鹽濃度。

2.4.2 有機營養(yǎng)成分的優(yōu)化 由表6可知，低濃度蔗糖組F1不定芽葉片卷曲，芽體較細，增殖系數(shù)較低；而高濃度蔗糖F4培養(yǎng)時不定芽葉片向背外卷，葉色變黃，增殖系數(shù)降低，長勢差；合適的蔗糖濃度(20～30 g·L-1)增殖效果最好，兩者不定芽增殖系數(shù)及芽高均無顯著性差異，芽體健壯，生長狀況較好，優(yōu)選F2可節(jié)省培養(yǎng)成本。

離體培養(yǎng)時添加適當?shù)奶烊惶砑游锟稍鰪娭参锓只?、生長發(fā)育。由表6可知，以空白G1為對照，椰子汁對增殖系數(shù)及芽高影響有顯著性差異，椰子汁可降低不定芽變異率，芽苗生長旺盛、粗壯，葉片濃綠、健康。尤以G3組增長系數(shù)及芽高指數(shù)最優(yōu)，長勢最佳。綜合上述實驗結(jié)果，適合貢菊不定芽誘導增殖的有機營養(yǎng)條件為蔗糖濃度20 g·L-1及椰子汁30 mL·L-1。

表5 無機營養(yǎng)成分對不定芽增殖的影響

注：同列數(shù)字后小寫字母表示在P=0.05水平上的顯著性差異；+表示芽長勢弱，++表示長勢一般，+++表示長勢較好，++++表示長勢良好。

表6 有機營養(yǎng)成分對不定芽增殖的影響

注：同列數(shù)字后小寫字母表示在P=0.05水平上的顯著性差異；+表示芽長勢弱，++表示長勢一般，+++表示長勢較好，++++表示長勢良好。

注：A.激素優(yōu)化后示意圖；B.天然添加物優(yōu)化后示意圖；C.優(yōu)化前不定芽黃化現(xiàn)象；D.優(yōu)化前不定芽玻璃化現(xiàn)象。圖1 貢菊離體不定芽誘導增殖

3 討論

內(nèi)源和外源植物生長物質(zhì)的種類和水平對植物的生長發(fā)育起關(guān)鍵作用[8]。在植物組織培養(yǎng)過程中，本試驗首先對細胞分裂素進行初步篩選，通過對比6-BA、KT和TDZ三種常用的細胞分裂素對貢菊不定芽誘導的影響，發(fā)現(xiàn)6-BA與KT在一定濃度范圍內(nèi)對不定芽誘導均有作用。在本研究進一步對不定芽誘導條件進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)KT誘導作用不及6-BA效果佳；過高濃度的6-BA會導致不定芽變異率升高，芽體矮化；添加生長素可提高不定芽誘導率，以6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1或6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1誘導效果最好，誘導條件激素種類和濃度范圍與陳黎等研究結(jié)果一致[9]。細胞分裂素和生長素的比例影響增殖系數(shù)和芽苗質(zhì)量，采用正交試驗對不定芽增殖影響因子進行篩選，可充分考慮各因子的相互作用，使研究結(jié)果具有實用性和可操作性[10]。結(jié)果表明貢菊對6-BA較敏感，單獨使用6-BA時芽體較細弱，生長緩慢，增殖系數(shù)低，而加入NAA和IBA后增殖系數(shù)明顯增高，且芽體健康健壯，最佳的增值條件為：6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，而在同屬植物菊花不定芽誘導研究中也表明適當比例的細胞分裂素和生長素組合使用對不定芽誘導效果比單一使用細胞分裂素效果更好[11]，這與本實驗研究結(jié)果一致。

在貢菊不定芽誘導增殖過程中，針對芽苗出現(xiàn)玻璃化、黃化等現(xiàn)象，本試驗對基本培養(yǎng)基無機和有機成分含量進行優(yōu)化，以便進一步提高不定芽的質(zhì)量。實驗結(jié)果表明低濃度大量元素由于營養(yǎng)供給不足而導致不定芽葉片發(fā)黃，芽體細弱，而高濃度大量元素則抑制不定芽的增殖，以標準MS大量元素濃度最佳。裘文達[12]試驗發(fā)現(xiàn)，低鹽濃度的培養(yǎng)基對菊花芽誘導率極差；陳黎[9]、李云玲[13]等在對貢菊的組織培養(yǎng)中均采用 MS 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，與本實驗結(jié)果一致。鐵與植物葉綠素的合成關(guān)系密切[14]，本研究結(jié)果表明低濃度鐵鹽導致不定芽葉片偏黃，而隨著濃度升高，葉片顏色由黃轉(zhuǎn)綠。缺鐵可能會直接導致葉片黃化，以1.5倍MS標準鐵鹽濃度增殖效果最佳，長勢旺盛。蔗糖是組培最常用的碳源之一，過高濃度蔗糖使培養(yǎng)基滲透壓升高，從而抑制不定芽增殖；20～30 g·L-1蔗糖適用于不定芽誘導增殖，優(yōu)選20 g·L-1可節(jié)省培養(yǎng)成本。早有研究發(fā)現(xiàn)添加天然添加物可促進植物生長，提高叢芽分化率[15]，本研究結(jié)果也表明添加30 mL·L-1椰子汁可有效提高不定芽增值率，促進芽體粗壯，提高不定芽質(zhì)量。

與誘導愈傷再分化叢芽相比，直接誘導不定芽省去了脫分化的步驟，同時誘導所得芽體健壯，變異程度較低。本研究對貢菊不定芽離體誘導及增殖培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，為控制貢菊的種苗質(zhì)量標準、離體快繁技術(shù)和工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，對貢菊種質(zhì)資源的可持續(xù)利用具有一定的參考價值。

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OptimizationofCultureConditionsinvitroofAdventitiousBudsInductionandProliferationofDendranthemamorifoliumTzvel.cv.Gongju

ZHANG Jiaying1，PANChaomei1*，SUJiaxian1，XIAOXinheng2

(1.GuangzhouUniversityofChineseTraditionalMedicine，GuangzhouPanyu510006，China；2.GuangdongHerbsourceTechnologyCompany，Meizhou514200，China)

Objective：The culture conditions of adventitious buds induction and proliferation were optimized to lay a foundation for establishing and perfecting the rapid propagation system ofDendranthemamorifolium.Methods：Single factor test，combination test and orthogonal test were used，also the compositions of basic medium were optimized to investigate the effect of different plant growth regulator on adventitious buds induction and proliferation.Results：The results showed that the optimum cytokinin for induction was 6-BA；the best medium for induction was MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1or 6-BA2.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；the best medium for propagation was MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1；the optimized basic medium compositions were：basic MS macronutrients concentration+1.5 times Fe+sucrose 20 g·L-1+coconut water 30 ml·L-1.Conclusion：6-BA has obvious effect，and also IBA and NAA had regulating effect on induction and propagation of adventitious beds，in addition，the improved medium could promote adventitious buds growth.

Dendranthemamorifolium；Adventitious buds induction and proliferation； optimization

2015-11-06)

2014公益性行業(yè)科研專項(201407002)

*

潘超美，教授，研究方向：藥用植物種質(zhì)資源評價與可持續(xù)利用；Tel：(020)39358249，Email：tcmbotany@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.017