陳平，龔建瑜，左曉霜，華杰，馬定乾，范源

(1.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

·基礎研究·

余甘子褐變過程中沒食子酸等四種成分含量變化及分析

陳平1，龔建瑜1，左曉霜1，華杰1，馬定乾1，范源2*

(1.云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

目的：測定并分析在相對恒溫密閉貯藏條件下新鮮余甘子褐變過程中沒食子酸、單寧酸、五沒食子?；咸烟?β-PGG)、β-胡蘿卜素的含量變化。方法：將余甘子果實20 ℃條件下用棕色廣口瓶密封避光儲藏，每3天用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素的含量及pH值和可滴定酸的變化。結果：余甘子中的沒食子酸在自采摘后第19天左右含量最高，余甘子中的單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素在剛采摘第1天含量最高，pH值在第22天最高，而可滴定酸在第4天最高。結論：實驗提示褐變過程中可滴定酸比pH值相對靈敏且與沒食子酸、單寧酸、β-PGG、胡蘿卜素呈相關性趨勢，提示沒食子酸和可滴定酸可作為褐變過程中質控指標之一，可以為余甘子果實儲藏、預防褐變提供一定的參考。

余甘子；沒食子酸；單寧酸；β-PGG；β-胡蘿卜素；RP-HPLC

余甘子Phyllanthusemblica是大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬(phyllanthus)落葉喬木或灌木藥用植物，生長在中國亞熱帶、熱帶部分地區(qū)，特別是干熱河谷地區(qū)。余甘子作為藥食兩用的植物，各個部分功用廣泛，涉及42種藥用功效。余甘子常被應用于傳統(tǒng)醫(yī)藥系統(tǒng)，如中國醫(yī)藥和阿育吠陀醫(yī)學。我國中醫(yī)藥體系認為，余甘子味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃二經，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳的功效，主要用于血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛口干等證。此外，余甘子具有補益、保肝、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗高血壓、降血脂等保健作用[1-2]。

余甘子以鞣質類、黃酮類、多糖和維生素C含量較多，果實含有酚類化合物，主要為訶尼酸(chebulinic acid)、鞣花酸(ellagic acid)、3-乙基沒食子酸(3-ethoxy-gallic acid)、訶子酸(chebulagic acid)、沒食子酸(gallic acid)等。揮發(fā)油類物質主要有β-波旁烯(β-bourbonene)、二十四醇(tetracosano1)、二十四烷(tetracosane)、丁香油酚(eugeno1)、β-丁香烯(β-Caryophyllene)、綠原酸(Chlorogenic acid)。此外，余甘子果實中含有槲皮素(quercetin)，蘆丁(rutin)，蛋白質，維生素B、B2、C及微量元素K、Zn、Mn等[3]。余甘子中主要化合物化學結構見圖1。

圖1 余甘子中主要化合物化學結構

沒食子酸(Gallic acid)亦稱五倍子酸或棓酸，是一種有機酸，可見于五倍子、漆樹、茶等植物中。余甘子果實中除含有維生素、氨基酸外，還富含鞣質類成分，其中包括沒食子酸，相關研究表明余甘子中沒食子酸可促進胰島素分泌，有一定的治療糖尿病的作用[4]。此外，Mahdi Vazirian等[5]通過測定阿育吠陀和伊朗常用藥方三果湯中的3味藥物中沒食子酸含量發(fā)現(xiàn)余甘子中所含沒食子酸最高。單寧酸(Tannic acid)又稱鞣質，單寧，鞣酸。單寧酸在藥理方面有較高活性，可抗腫瘤、抗突變、抗脂質過氧化等，且其在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面具有較高的活性。研究表明，余甘子果中單寧酸有利于增加風味品質與維生素C的保存[6-9]。五沒食子?；咸烟?β-PGG)，屬于多酚類化合物，是水解單寧的組成部分，王維聰?shù)萚10]對44種中藥中β-PGG含量進行測定，其中五倍子中β-PGG的含量最高。β-PGG具有抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗血管再生等活性，并且能抑制人胰島淀粉樣多肽(IAPP)的沉積，保護胰島β細胞的作用[11-14]。余甘子中β-PGG相關報道較少。

由于余甘子貯藏過程中易發(fā)生褐變，使貯藏時間縮短，可對余甘子鮮果品質造成影響。脫落酸(ABA)是以異戊二烯為基本單位的一種15碳的類倍半萜類、具有抑制生長作用的植物激素，在植物成熟、衰老組織或進入休眠的器官中含量豐富。ABA通過類胡蘿卜素途徑合成，胡蘿卜素前體形成胡蘿卜素可作為ABA形成的中間反應前體[15]。而β-胡蘿卜素作為類胡蘿卜素之一，是自然界中普遍存在最穩(wěn)定的天然色素之一，故本實驗將β-胡蘿卜素作為測定觀察指標之一。

可滴定酸，又稱總酸，指植物中所有酸性成分的總量，包括已離解成H+的酸的濃度與未離解的酸的濃度，因其大小可借助標準堿液滴定來求得。一般以測定果實中可滴定酸作為果實品質的標準之一，采摘后可滴定酸增加可能與果實中淀粉迅速降解形成大量的糖類進入三羧酸循環(huán)后進一步形成各種有機酸有關，隨時間延長可滴定酸下降與其作為呼吸作用或轉換成其他物質被消耗有關。

本實驗根據(jù)余甘子的化學性質及沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素的化學特性，考察余甘子在相對密封、相對恒溫條件下的褐變過程中沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素含量及可滴定酸、pH值的變化。

1 材料

1.1 材料與試劑

云南楚雄采摘的新鮮余甘子果實。乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，丙酮(分析純)，正己烷(分析純)，磷酸(分析純)均購自云南丹赤貿易有限公司，純凈水。β-PGG對照品(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：14021908，純度：98%)、沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204)、單寧酸對照品(成都邁斯克醫(yī)藥科技有限公司，批號：130721)、β-胡蘿卜素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100445)。

1.2 儀器

D2KW-D電熱恒溫水浴鍋，Agilent1200型高效液相色譜儀(VWD檢測器)，萬分之一分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，酸度計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 儲藏方法

將適量余甘子果實用棕色廣口瓶封口膠密封放入20 ℃恒溫箱中避光儲藏。

2.2 沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素對照品溶液的制備

精密稱定沒食子酸對照品0.40 mg，用50%甲醇制成40 μg·mL-1的溶液，備用。精密稱取0.60 mg單寧酸對照品，用乙醇、水、丙酮(70∶29∶1)溶液溶解并定容，制備成質量濃度為60 μg·mL-1的單寧酸對照品溶液，備用。精密稱定β-PGG對照品1.00 mg，用甲醇制成100 μg·mL-1的溶液，備用。精密稱定β-胡蘿卜素4.00 mg，用正己烷制成400 μg·mL-1的溶液，備用。

2.3 沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素供試品溶液的制備

2.3.1 沒食子酸、單寧酸、β-PGG供試品溶液制備 取50 g余甘子果肉(去核)，精密稱定，加入適量石英砂研磨，盡量搗碎，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱至70 ℃回流1.5 h。放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45 μm濾膜過濾。即得。

2.3.2 胡蘿卜素供試品溶液的制備 取2.5 g余甘子果肉(去核)，置具塞錐形瓶中，錐形瓶用錫箔紙包裹已避光，加入50 mL正己烷-丙酮-乙醇(6∶3∶1)，放于避光處靜置4 h后，搖晃錐形瓶靜置2 min，取上層清液，用0.45 μm濾膜過濾。即得。

2.4 沒食子酸含量測定方法

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.2%磷酸溶液(5∶95)為流動相；檢測波長：273 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL[16]。

2.4.2 沒食子酸線性關系考察 精密稱取對照品0.50 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液。按上述沒食子酸色譜條件分別取2、4、6、10、12 μL進樣，以沒食子酸的峰面積(Y)對對照品的質量(X)進行線性回歸，得方程Y=1 892.4X-68.546，r=0.996 5。結果表明：沒食子酸峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為0.1～0.6 μg。

2.5 單寧酸含量測定方法

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水(80∶20)為流動相；檢測波長為275 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：2.0 μL[17]。

2.5.2 單寧酸線性關系考察 精密稱取對照品0.80 mg，用乙醇-水-丙酮(70∶29∶1)溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液。按上述單寧酸色譜條件分別取2、4、6、8、10 μL進樣，以單寧酸的峰面積(Y)對對照品的質量(X)進行線性回歸，得方程Y=7 330.5X-230.66，r=0.999 3。結果表明單寧酸峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為0.16～0.80 μg。

2.6 β-PGG 含量測定方法

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0 min：乙腈-0.1%磷酸(10∶90)，15 min：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)，15.1 min：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)，20 min：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)；檢測波長為281 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.6.2β-PGG線性關系考察 精密稱取對照品1.0 mg，用50 %的甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液。按上述沒食子酸色譜條件分別取13、15、17、19、21 μL進樣，以β-PGG的峰面積(Y)對對照品的質量(X)進行線性回歸，得方程Y=2 195.4X-48.33，r=1.0。結果表明β-PGG峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為1.3～1.9 μg。

2.7 β-胡蘿卜素含量測定方法

2.7.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈(85∶15)；檢測波長為450 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.7.2β-胡蘿卜素線性關系考察 精密稱取對照品4.0 mg，用正己烷溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻作為儲備液。按上述沒食子酸色譜條件分別取13、15、17、19、21 μL進樣，以β-胡蘿卜素的峰面積(Y)對對照品的質量(X)進行線性回歸，得方程Y=21.309X-99.941，r=0.999 8。結果表明β-胡蘿卜素峰面積值與質量有良好的線性關系，線性范圍為5.2～8.4 μg。

2.8 pH值與可滴定酸的測定

取10 g去核余甘子，精密稱定，加適量石英砂研勻，加20 mL蒸餾水導入三角瓶。80 ℃水浴30 min，冷卻過濾，作為儲備液。

用酸度計測定pH值，可滴定酸測定：取貯備液10 mL采用0.1 ml·L-1的NaOH滴定至pH=8.1，以蘋果酸計(K=0.067)代入公式(1)。

TTA(%)=(A×0.1×0.067×20)/(10×D)×100

(1)

式中：

TTA—可滴定酸；

D—取儲備液的體積；

A—NaOH消耗的體積。

3 結果與分析

3.1 精密度試驗

精密吸取沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素對照品溶液，連續(xù)進樣4次.以峰面積計算RSD值，沒食子酸、單寧酸、β-PGG、β-胡蘿卜素RSD值分別為0.27%、0.79%、0.03%、1.61%。精密度試驗結果表明，儀器精密度良好。色譜圖見圖2～5。

注：A.沒食子酸對照品；B.沒食子酸樣品。圖2 沒食子酸色譜圖

注：A.單寧酸對照品；B.單寧酸樣品。圖3 單寧酸色譜圖

注：A.PGG對照品；B.PGG樣品。圖4 β-PGG色譜圖

注：A.胡蘿卜素對照品；B.胡蘿卜素樣品。圖5 β-胡蘿卜素色譜圖

3.2 結果分析

在恒溫相對密封儲存條件下，余甘子自采摘后22 d中沒食子酸、單寧酸、β-PGG含量與β-胡蘿卜素含量變化見表1。余甘子中的沒食子酸在自采摘后第19天左右含量最高，剛采摘第1天含量最低，隨著儲存天數(shù)的增加，沒食子酸的含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(見圖6)；余甘子中的單寧酸在剛采摘第1天含量最高，余甘子中的PGG在自采摘后第1天左右含量最高，到第4天左右隨著儲存天數(shù)的增加，單寧酸減少時PGG含量呈增加趨勢，單寧酸含量增加時PGG含量呈減少趨勢(見圖7、8)；胡蘿卜素含量在第1天含量最高，到第4天含量呈急劇下降趨勢，第4天后下降趨勢逐漸平穩(wěn)，19 d后無法測得胡蘿卜素含量(見圖9)。

沒食子酸含量增多，可能因為采摘后發(fā)生呼吸躍變等原因導致余甘子單寧酸、β-PGG等化合物發(fā)生分解反應，使沒食子酸從這些化合物中解離、脫落，并發(fā)生褐變[18]。余甘子果實中的單寧酸是一種易水解的多酚化合物，其能水解產生沒食子酸、β-PGG等中間產物，由此推測單寧酸和PGG水解產生沒食子酸，使沒食子酸含量增大，同時單寧酸也水解為PGG使PGG含量增加，此外，這些中間產物之間存在相互轉化的可能，果實中的其他生物活性成分也可能對余甘子中單寧酸、沒食子酸、β-PGG的含量變化產生相應影響。β-胡蘿卜素在第1天到第4天含量變化明顯，隨時間增加出現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，且19 d后無法測出β-胡蘿卜素，推測其在果實成熟時作為前體物質產生脫落酸(ABA)或生成其他物質，故在余甘子采摘后測定胡蘿卜素對研究余甘子褐變意義不大。

隨儲藏時間的增加，pH值的變化相對恒定，到22 d余甘子褐變后期時pH值最大，而在儲藏第4天時，可滴定酸值達到最大(見表2)。隨儲藏時間增加，pH值變化與余甘子中沒食子酸、β-PGG、單寧酸、β-胡蘿卜素含量變化無明顯相關性，而可滴定酸在第4天單寧酸急劇下降時達到最大，對β-PGG、單寧酸、β-胡蘿卜素含量有一定關聯(lián)性(見圖10、11)。因此，認為可滴定酸、單寧酸、β-PGG在探究余甘子褐變過程時可作為早期褐變的敏感指標之一，沒食子酸可作為褐變中期指標之一，研究為余甘子果實品質保證提供一定參考。

表1 沒食子酸、單寧酸、β-PGG含量及β-胡蘿卜素含量(n=3)

圖6 余甘子中沒食子酸含量變化

圖7 余甘子中單寧酸含量變化

圖8 余甘子中β-PGG含量變化

圖9 余甘子中β-胡蘿卜素含量變化

表2 pH值、可滴定酸值(n=3)

圖10 余甘子褐變過程中pH值的變化

圖11 余甘子褐變過程中可滴定酸的變化

4 結論

余甘子果實中含有豐富的多酚化合物，通過測定不同儲存天數(shù)下余甘子中沒食子酸、單寧酸、PGG、胡蘿卜素的含量，得出了保證余甘子鮮果中這些活性成分的較適儲存時間。本實驗提示單寧酸、β-PGG可作為余甘子褐變過程中的早期質控指標，沒食子酸可作為褐變中期指標之一。此外，實驗認為可滴定酸測定可作為余甘子褐變產生的早期敏感指標之一，特別是可滴定酸測定作為余甘子褐變的標準比pH值測定更加準確，研究為余甘子果實開發(fā)利用及褐變防控提供一定的參考。

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ChangesandAnalysisofGallicacidTannicacidβ-PGGβ-caroteneofPhyllanthusemblicainBrowning

CHENPing1，GONGJianyu1，ZUOXiaoshuang1，HUAJie1，MADingqian1，F(xiàn)ANYuan2*

(1.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China；2.TheFirstAffiliatedHospitalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To determine the change of gallic acid，tannic acid，β-PGG，beta-carotene in freshPhyllanthusemblicain browning process in storage.Methods：FreshPh.emblicafruit was stored without light and with brown wide-mouth bottle at 20 ℃.Gallic acid，tannic acid，β-PGG，β-carotene，titration acid and pH value inPh.emblicawere determined by RP-HPLC every 3 days，and pH value and titratable acid were also measured.Results：Gallic acid inPh.emblicain 19 days after picking was the highest.Tannic acid，β-PGG，β-carotene inPh.emblicawas the highest.pH value was the highest at day 22.Titratable acid was the highest at day 4.Conclusion：The results suggest that titratable acid more sensitive than pH value in browning process and related to gallic acid，tannic acid，β-PGG andβ-carotene.Gallic acid can be served as one of the browning process quality control index and provide the reference forPh.emblicastorage or prevention of browning.

Phyllanthusemblica；gallic acid；tannic acid；β-carotene；β-PGG；RP-HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.016

2015-10-31)

*

范源，教授，研究方向：天然活性產物及糖尿病治療；E-mail：1647909799@qq.com