馬衛(wèi)敬，王慧嶺，陳 昱，劉敏勝

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊 065000)

?

角毛藻冷藏存儲最長時間的探討

馬衛(wèi)敬，王慧嶺，陳 昱，劉敏勝*

(新奧科技發(fā)展有限公司，煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊 065000)

采用離心后不同的低溫保存方式和添加新鮮培養(yǎng)基的方法，對角毛藻離心收集后儲存的最長時間進行了研究。結果表明，添加新鮮培養(yǎng)基的儲存方法優(yōu)于直接添加藻液的方法，并且存儲時間長；角毛藻在3 000 r/min或較低轉數離心后，藻泥可以添加新鮮培養(yǎng)基儲存于-2 ℃冰箱，至少儲存35 d，再培養(yǎng)不影響生長。角毛藻儲存溫度越低，儲存時間就越長，但要在角毛藻不結冰的情況下。此保藏方法可以應用于角毛藻銷售中轉儲存。

角毛藻；離心；儲存；再培養(yǎng)

牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)為耐高溫單細胞藻類，在正常情況下細胞長3.7～8.7 μm，寬2.9～8.3 μm，角毛長10.2～14.5 μm。色素體1個，呈黃褐色。細胞大多數單獨生活，有時也由2～3個集合而成短的群體。在泥蚶和牡蠣等貝類育苗生產中，角毛藻作為鮑魚、貝類等幼體的優(yōu)質餌料，與其他單胞藻相比具有耐高溫、繁殖速度快、抗污染能力強等優(yōu)點[1]，深受水產養(yǎng)殖者的歡迎。梁妍等[2]研究離心和冷藏對牟氏角毛藻再培養(yǎng)的影響，發(fā)現4 ℃冷藏后的角毛藻常溫下再培養(yǎng)效果較差。低溫冷藏會影響藻細胞的正常生長，并且隨著冷藏時間的延長，細胞再培養(yǎng)愈來愈困難。但是，在實際養(yǎng)殖生產中，若保存時間過短會使藻變質壞掉，最終導致資源浪費。筆者探討了角毛藻冷藏存儲的最長時間。

1　材料與方法

1.1試驗材料試驗所用角毛藻由新奧科技發(fā)展有限公司藻種庫提供。試驗藻種在跑道池中養(yǎng)殖，達到一定產量后進行收集。

1.2培養(yǎng)基配方角毛藻細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配方參考文獻[3]。

1.3儀器與藥品

1.3.1儀器。冰箱(Electrolux)，型號BCD-271WFC；臺式高速冷凍離心機，型號sigma3K15/1079；電子顯微鏡，型號Olympus CX31RTSF。

1.3.2藥品。除微量元素為500 g/瓶的分析純外，其他均為50 kg食品級營養(yǎng)鹽。

1.4試驗方法將培養(yǎng)的角毛藻4 000 r/min離心5 min后添加新鮮培養(yǎng)基，將獲得的藻液與藻泥同時儲存于4 ℃和-2 ℃冰箱中。冷凍儲存23 d后，在光照強度100 μmol/(m2·s)下進行再培養(yǎng)。使用紫外分光光度計于波長750 nm處測定OD值。使用電子顯微鏡觀察不同條件儲存后的細胞形態(tài)。

2　結果與分析

不同存儲條件下藻泥再培養(yǎng)情況的對比如圖1所示。從圖2可以看出，-2 ℃下藻泥細胞邊緣模糊，細胞有破損(圖2A)；-2 ℃下藻泥添加培養(yǎng)基冷凍的角毛藻細胞邊緣清晰，細胞狀態(tài)正常(圖2B)。

注：A.接種前；B.培養(yǎng)3 d后。a.4 ℃下儲存的藻泥；b.4 ℃下儲存的藻液；c.-2 ℃儲存下的藻泥；d.-2 ℃下儲存的藻液。Note：A.Before inoculation；B.Culture for 3 d；a.Algae mud under -2 ℃；b.Algae liquid stored at 4 ℃；c.Algae mud under -2 ℃；d. Algae liquid stored at -2 ℃.圖1　不同存儲條件下藻泥再培養(yǎng)情況的對比Fig.1　Comparison of subculture situation of algae mud under different storage conditions

注：A.-2 ℃下儲存的藻泥；B.-2 ℃下儲存的藻液。Note：A.Algae mud under -2 ℃；B.Adding culture medium in algae mud and algae liquid stored at -2 ℃.圖2　-2 ℃下儲存的角毛藻細胞的鏡檢結果對比Fig.2　Comparison of algae cell microscopy under -2 ℃ storage condition

圖3　4 ℃下培養(yǎng)不同時間藻泥和藻液的OD值對比Fig.3　Comparison of OD values of algae mud and liquid cultured at 4 ℃ for different time periods

由表1可知，在樣品不同條件下儲存23 d后進行再培養(yǎng)，發(fā)現4 ℃藻泥、4 ℃藻液、-2 ℃藻泥均死亡變臭，不能進行再培養(yǎng)。結合冷凍試驗結果可知，離心后藻液在4 ℃下儲存的時間約為15 d，20 d左右會出現異味，因此儲存23 d再培養(yǎng)時就會影響藻體生長。但是，-2 ℃下儲存23 d后的藻

注：A.接種前；B.接種后。Note：A.Before inoculation；B.After inoculation. 圖4　角毛藻再培養(yǎng)生長情況的對比Fig.4　Comparison of growth situation of C.muelleri subculture

液再培養(yǎng)不受影響。 雖然管式離心后的藻泥濃度較高，但不可以直接在冰箱中儲藏；離心后的藻泥可以添加少量的培養(yǎng)基儲存于-2 ℃冰箱中，儲存23 d也不影響藻品質，儲存33 d后無異味，儲存35 d后出現少量異味，但不影響生長；用幾批收集后直接出售的藻液在4 ℃冰箱中儲存6 d就已變臭，這是因為藻泥用藻液稀釋，并且在第6天鏡檢時發(fā)現有活躍的原生動物，所以建議收集后的藻泥用藻稀釋，這樣會延長儲存時間。角毛藻只要不結冰，取出正常培養(yǎng)就不受影響。

表1　不同儲存條件下藻泥的再培養(yǎng)情況

3　結論

(1)角毛藻在一定轉數離心后，藻泥添加養(yǎng)殖的藻液在4 ℃下儲存2～3 d后出現異味。離心后的藻泥添加新鮮培養(yǎng)基后，儲存時間變長，-2 ℃下可以儲存35 d。原藻液中含有原生動物等容易變質，離心后的藻泥因為細菌數量減少變得不易引起變質，添加的新鮮培養(yǎng)基中原生動物較少，故在低溫下保存時間較長。

(2)-2 ℃為介于-4～4℃之間，不易結冰，基本符合儲

存要求。角毛藻在不結冰的低溫條件下儲存后，基本不影響生長。

(3)此儲存方法可以應用于角毛藻銷售中轉儲存。

[1] 鄭忠明，金春華，馮堅.牟氏角毛藻的生產性培養(yǎng)技術[J].水產科學，2002,21(6)：20-21.

[2] 梁妍，鄒寧，潘曰磊，等.離心·冷藏對牟氏角毛藻再培養(yǎng)的影響[J].安徽農業(yè)科學，2008，36(33)：14459-14460，144624.

[3] 鄒寧，李艷，孫東紅.幾種有經濟價值的微藻及其應用[J].煙臺師范學院學報，2005，21(1)：59-63.

Discussion on the Longest Storage Time ofChaetocerosmuelleriunder Refrigeration Condition

MA Wei-jing, WANG Hui-ling, CHEN Yu, LIU Min-sheng*

(ENN Science and Technology Development Co., Ltd., State Key Laboratory of Coal Based Low Carbon Energy, Langfang, Hebei 065000)

After centrifugation, different low-temperature storage method and the method of adding fresh culture medium were applied to research the longest storage time ofChaetocerosmuelleri. Results showed that the storage method of adding fresh culture medium was superior to directly adding algae liquid. After algal biomass was centrifuged at speed of 3 000 r/min or lower speed, fresh medium was added into the sludge and stored at -2 ℃ in refrigerator for at least 35 d. Subculture did not affect the growth. The lower storage temperature ofC.muellerimade longer storage time under the condition of non-freezing. This storage method could be used for transitional storage in the sale ofC.muelleri.

Chaetocerosmuelleri;Centrifugation; Storage; Subculture

馬衛(wèi)敬(1983- )，女，河北邯鄲人，助理工程師，從事微藻養(yǎng)殖與光反應器制造等方面的研究。*通訊作者，副研究員，從事微藻高效養(yǎng)殖和微藻規(guī)模化養(yǎng)殖研究。

2016-05-20

S 984.4

A

0517-6611(2016)18-144-02