于　瑩，郭文棟，趙麗娟，吳建忠，程莉莉，趙東升，胡瑩瑩，吳廣文，關(guān)鳳芝，袁紅梅*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱　150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱　150086；3.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱　150040；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，哈爾濱　150086）

亞麻纖維素合酶LuCesA8基因克隆與表達(dá)分析

于瑩1,2，郭文棟3，趙麗娟1,4，吳建忠2，程莉莉2，趙東升2，胡瑩瑩2，吳廣文2，關(guān)鳳芝1,2，袁紅梅1,2*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086；3.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱150040；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，哈爾濱150086）

以亞麻快速生長(zhǎng)期莖部組織總RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR克隆纖維素合酶基因LuCesA8（基因ID：Lus10029245）全長(zhǎng)開(kāi)放讀碼框序列。序列分析結(jié)果表明，開(kāi)放讀碼框全長(zhǎng)2 967 bp，共編碼988個(gè)氨基酸。通過(guò)多氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與麻風(fēng)樹(shù)CesA8蛋白親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)87%，與胡楊、可可樹(shù)、雷蒙德氏棉及芝麻CesA8蛋白氨基酸序列相似性分別為86%、85%、85%、81%。熒光定量PCR結(jié)果表明，該基因在亞麻不同發(fā)育階段表達(dá)水平存在顯著差異，快速生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，花期和綠熟期次之，苗期最低。研究為揭示LuCesA8基因在次生細(xì)胞壁纖維素合成中的作用奠定基礎(chǔ)。

亞麻；纖維素合酶；克??；表達(dá)分析

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-8-24 15:04:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160824.1504.010.html

于瑩,郭文棟,趙麗娟,等.亞麻纖維素合酶LuCesA8基因克隆與表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(8):39-45.

Yu Ying,Guo Wendong,Zhao Lijuan,et al.Cloning and expression analysis of the cellulose synthase geneLuCesA8 in flax [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(8):39-45.(in Chinese with English abstract)

纖維素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁重要組成部分，對(duì)維持植物細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度尤為重要。纖維素含量因物種差異而不同，在種子纖維植物。如棉花、木棉種子絨毛中纖維素含量高達(dá)95%～99%，而在韌皮纖維作物如亞麻纖維中，纖維素含量約為80%～ 90%，木材和竹材中纖維素含量約為40%～50%[1]。植物中纖維素占總生物量1/3，每年由綠色植物光合作用產(chǎn)生纖維素達(dá)1011t[2]。深入研究纖維植物中纖維素生物合成過(guò)程，挖掘控制纖維發(fā)育重要基因，通過(guò)遺傳操作改良植物纖維品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。

纖維細(xì)胞發(fā)育過(guò)程復(fù)雜，受多基因表達(dá)調(diào)控。在高等植物中，纖維素合酶（Cellulose synthase，CesA）超家族，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）家族2，負(fù)責(zé)催化纖維素合成[3]。纖維素合酶在細(xì)胞膜上組裝成纖維素合酶復(fù)合體（Cellulose synthase complex, CSC），由6個(gè)大亞基組成，每個(gè)大亞基包含6個(gè)CesA蛋白，形成由36個(gè)單體組成的玫瑰狀復(fù)合體[4-6]。纖維素一般以微纖絲（Microfibril）形式存在，每條微纖絲橫截面平均有36條β-1,4-D-葡聚糖鏈，每條葡聚糖鏈由幾千到上萬(wàn)個(gè)單糖分子組成[5]。目前已從多種植物中鑒定出CesA基因，毛果楊（Populus trichocarpa）中鑒定出18個(gè)CesA基因，小麥中鑒定出22個(gè)CesA基因，擬南芥中鑒定出10 個(gè)CesA基因。研究發(fā)現(xiàn)，植物初生、次生細(xì)胞壁形成涉及不同纖維素合酶[7-10]，在擬南芥中的10個(gè)CesA蛋白中，AtCesA1、AtCesA3和AtCesA6主要參與初生細(xì)胞壁合成，AtCesA2、AtCesA5和AtCe?sA9被視為AtCesA6的同源蛋白，這些蛋白之間功能冗余，AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8則參與次生細(xì)胞壁合成[11]。目前，國(guó)內(nèi)外纖維發(fā)育研究主要集中在木質(zhì)纖維和種子纖維（如楊樹(shù)、棉花等），而韌皮纖維作物（如麻類(lèi)）研究相對(duì)滯后。

亞麻（Linum usitatissimum L.）隸屬亞麻科，是重要韌皮纖維作物，具有基因組小、自花授粉等特點(diǎn)。目前，亞麻已成為研究韌皮纖維發(fā)育和次生細(xì)胞壁形成最理想的模式植物。本研究以高纖亞麻品種Diana為試驗(yàn)材料，克隆參與次生細(xì)胞壁合成的纖維素合酶基因LuCesA8，利用生物信息學(xué)方法分析序列，并研究LuCesA8基因在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)特性，為深入理解次生細(xì)胞壁纖維素合成機(jī)理及通過(guò)基因工程改良亞麻等作物纖維品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

高纖亞麻品種Diana、低纖亞麻品種白花種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院民主園區(qū)試驗(yàn)田，按照BBCH劃分法[12]，取BBCH19、32、35、55、58、61、65、69、75、78等發(fā)育時(shí)期莖中部組織，取材后迅速放入液氮速凍，放置于-80℃冰箱保存，提取RNA。

試劑包括RNA提取試劑盒（天根公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）；KOD聚合酶（TOYOBO公司）；DNA膠回收試劑盒（OMEGA公司）及克隆載體pMD18-T（TaKaRa公司）。引物合成和基因測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1總RNA提取與全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增

提取樣品總RNA，具體提取過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。取1 μg RNA，20 μL反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)亞麻纖維素合酶基因LuCesA8 （Lus10029245）CDS全長(zhǎng)序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，LuCesA8F:5'ATGCAATCC GCCGGCGCC 3'，LuCesA8R:5'TTAAGCACCTTGA GCTTTG 3'。采用RT-PCR方法擴(kuò)增基因，擴(kuò)增體系含2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL、dNTP （2 mmol·L-1）10 μL、5'及3'primer（10 μmol·L-1）各2 μL、模板cDNA 1 μL、KOD FX Neo（1 U· μL-1）1 μL，滅菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性5 min；循環(huán)為98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸2 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體上，測(cè)序分析。

1.2.2序列分析方法

ProtParam軟件（http://web.expasy.org/protparam/）分析該蛋白分子質(zhì)量與等電點(diǎn)；TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域；ProtScale（http://web.expasy.org/ protscale/）在線軟件預(yù)測(cè)該氨基酸序列疏水性/親水性；NetPhos 2.0預(yù)測(cè)LuCesA8氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)。PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白亞細(xì)胞定位；SOPMA（http://npsa-pbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/PSA/npsa_sop?ma.html）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，Smart軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。ClustalW（1.83）及Genedoc軟件作纖維素合酶基因氨基酸多序列比對(duì)分析，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3LuCesA8基因定量表達(dá)分析

選取Actin、UBI為內(nèi)參基因，LuCesA8及內(nèi)參基因熒光定量引物序列如表1所示，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至同一濃度，然后按照試劑盒SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa）PCR擴(kuò)增。12 μL反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 6 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4.5 μL。每個(gè)樣品3次重復(fù)，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性30 s，94℃12 s，56℃45 s，72℃45 s，78.5℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)。利用BIO-RAD公司生產(chǎn)實(shí)時(shí)定量PCR儀擴(kuò)增，計(jì)算2-△△Ct值確定不同基因相對(duì)表達(dá)量。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1　Primers sequences for Real-time PCR

2　結(jié)果與分析

2.1亞麻L(zhǎng)uCesA8基因擴(kuò)增

以Diana品種cDNA第一條鏈為模板作PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一清晰條帶（見(jiàn)圖1）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體，測(cè)序分析，經(jīng)測(cè)序長(zhǎng)度為2 967 bp，編碼988個(gè)氨基酸。

圖1　LuCesA8基因克隆電泳結(jié)果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of LuCesA8 gene cloning PCR products

2.2亞麻L(zhǎng)uCesA8基因序列分析

該基因編碼蛋白分子質(zhì)量為111.3 ku，蛋白理論等電點(diǎn)為6.73，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為107個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為104個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.89，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)為85.04，蛋白疏水性為-0.126，該蛋白無(wú)信號(hào)肽。通過(guò)NetPhos 2.0預(yù)測(cè)LuCesA8氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該蛋白有28個(gè)Ser、10個(gè)Thr和14個(gè)Tyr可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（見(jiàn)圖2）。在線軟件PSORT分析該蛋白亞細(xì)胞定位情況，預(yù)測(cè)該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜上。SOPMA分析軟件預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，該蛋白由α-螺旋（34.92%）、β-折疊（9.72%）、不規(guī)則盤(pán)繞（36.44%）、延伸鏈（18.93%）組成。

通過(guò)Smart軟件分析預(yù)測(cè)亞麻L(zhǎng)uCesA8蛋白結(jié)構(gòu)模式見(jiàn)圖3，該蛋白有8個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域，2個(gè)在N-端，6個(gè)在C-端。蛋白N末端區(qū)有1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)ZnF（Zinc-finger），該結(jié)構(gòu)上有1個(gè)保守序列CxxC（半胱氨酸氨-xx-半胱氨酸氨），該結(jié)構(gòu)域功能尚不清楚，但推測(cè)在纖維素合酶復(fù)合體中這些結(jié)構(gòu)域與蛋白間相互作用有關(guān)，是維持纖維素合成酶復(fù)合體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要功能區(qū)。ZnF結(jié)構(gòu)域后有1個(gè)高變區(qū)（HVR-I）和2個(gè)跨膜區(qū)，第2個(gè)跨膜區(qū)上存在1個(gè)保守基序SXXCEXWF；在第2與第3兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間是酶的中央結(jié)構(gòu)域，其間有1個(gè)蛋白序列高變區(qū)Ⅱ（HVR-Ⅱ），高變區(qū)Ⅱ兩邊各有1個(gè)保守區(qū)域CR-1和CR-2，CR-1區(qū)含有一個(gè)保守D-天冬氨酸殘基和保守的天冬氨酸殘基DxD，該區(qū)域可結(jié)合纖維素合成的底物，CR-2區(qū)除含1個(gè)保守D-天冬氨酸殘基外，還有保守序列QxxRW，與纖維素合成酶催化活性有關(guān)。

圖2　LuCesA8蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2　Predicted phosphorylation sites in LuCesA8

圖3　LuCesA8蛋白結(jié)構(gòu)特征Fig.3　Protein features of LuCesA8

以BLASTP程序進(jìn)行蛋白序列同源性比對(duì)，該蛋白在GenBank中與麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）CesA8蛋白（XP_012091811.1）氨基酸序列同源性最高，相似性為87%。其次為胡楊（Populus euphratica）、可可樹(shù)（Theobroma cacao）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）、芝麻（Sesamum indicum）CesA8蛋白，氨基酸序列相似性分別為86%、85%、85%、81%。利用ClustalX多重序列比較分析（見(jiàn)圖4），發(fā)現(xiàn)不同物種間纖維素合酶CesA8序列保守性較高。

利用Clustal軟件對(duì)LuCesA8氨基酸序列與選取的24個(gè)其他物種纖維素合酶CesA8氨基酸序列作多序列比對(duì)，MEGA5.0軟件以鄰位相接法（NJ法）構(gòu)建CesA8蛋白分子進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖5），采用Bootstrap重復(fù)1 000次檢驗(yàn)，分析亞麻L(zhǎng)uCesA8基因與其他物種纖維素合酶CesA8關(guān)系。在該系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，亞麻L(zhǎng)uCesA8蛋白與胡楊（Populus euphra?tica）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）親緣關(guān)系最近，聚在1個(gè)分支中。

2.3亞麻纖維素合酶基因LuCesA8表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR分析LuCesA8基因不同發(fā)育階段不同品種表達(dá)情況。Diana與白花同時(shí)播種，同時(shí)取材。從苗期至快速生長(zhǎng)期，這兩個(gè)品種生長(zhǎng)速度相同，發(fā)育時(shí)期同步。進(jìn)入現(xiàn)蕾期后白花發(fā)育較快，成熟期早于Diana。定量結(jié)果表明，兩個(gè)品種LuCesA8基因表達(dá)模式基本一致，苗期（BBCH19）表達(dá)量均較低，進(jìn)入快速生長(zhǎng)期（BBCH32）時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值，進(jìn)入現(xiàn)蕾期基因表達(dá)量下降，至花期（BBCH65）時(shí)該基因表達(dá)量上升至第二次高峰。在BBCH69時(shí)，出現(xiàn)蒴果，蒴果數(shù)量較少時(shí)，該基因表達(dá)量降至最低，但隨蒴果數(shù)量增加該基因表達(dá)量逐漸增加（見(jiàn)圖6）。

圖4　CesA8蛋白氨基酸序列多序列比對(duì)Fig.4　Multiple alignment of CesA8 protein sequence

圖5　不同植物物種纖維素合酶CesA8分子進(jìn)化關(guān)系Fig.5　Phylogenetic relationship of CesA8 proteins from different species

圖6　不同品種亞麻莖不同發(fā)育階段LuCesA8基因表達(dá)量變化Fig.6　Changes of LuCesA8 relative expression level at different developmental stages of flax stem in different varieties

3　討論與結(jié)論

亞麻纖維主要為初生韌皮纖維，纖維束由12～ 40個(gè)纖維細(xì)胞組成[13]。亞麻韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育主要經(jīng)歷兩個(gè)階段：細(xì)胞伸長(zhǎng)和次生細(xì)胞壁加厚，兩個(gè)時(shí)期互不重疊，分別決定韌皮纖維長(zhǎng)度和強(qiáng)度，次生細(xì)胞壁加厚與韌皮纖維品質(zhì)密切相關(guān)。韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育過(guò)程復(fù)雜，受多基因表達(dá)調(diào)控，隨亞麻基因組測(cè)序完成，很多與韌皮纖維細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因，如CesA、Susy、Kor等被相繼鑒定和克隆[14-16]。其中，CesA是催化纖維素合成關(guān)鍵酶之一，是植物纖維素合成研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。

植物CesA基因以超基因家族形式存在，不同成員參與不同組織、器官或細(xì)胞壁層次纖維素合成[17]。目前，在亞麻基因組中已發(fā)現(xiàn)14個(gè)CesA基因，但被克隆的CesA基因大多參與初級(jí)細(xì)胞壁形成，而參與次級(jí)細(xì)胞壁合成的CesA基因較少[18-19]。本研究通過(guò)RT-PCR法獲得亞麻纖維素合酶LuCe?sA8（Lus10029245）基因全長(zhǎng)開(kāi)放讀碼框序列。序列分析結(jié)果表明，開(kāi)放讀碼框全長(zhǎng)2 967 bp，共編碼988個(gè)氨基酸。通過(guò)多氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與麻風(fēng)樹(shù)CesA8蛋白親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)87%，與胡楊、可可樹(shù)、雷蒙德氏棉及芝麻CesA8蛋白氨基酸序列相似性分別為86%、85%、85%、81%，推測(cè)該蛋白可能參與次生細(xì)胞壁纖維素合成。該蛋白具有植物纖維素合酶基因保守結(jié)構(gòu)特征：1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)ZnF，2個(gè)可變區(qū)HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ，2個(gè)保守區(qū)CR-1和CR-2，8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及保守基序CxxC、SXXCEXWF、DxD及QxxRW等。

Day等分析亞麻開(kāi)花期中期韌皮纖維組織表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)其中4.4%ESTs與細(xì)胞壁形成和成熟相關(guān)，其中纖維素合酶（CesA）、β-木糖苷酶，木葡聚糖核內(nèi)轉(zhuǎn)移/水解酶（XTH）、β-半乳糖苷酶及過(guò)氧化物酶基因均有較高表達(dá)量[14-15]。毛果楊中PtCe?sA8基因在木質(zhì)部特異高表達(dá)，主要參與次生細(xì)胞壁形成[17,20-21]。在擬南芥中AtCesA8是次生壁形成必需基因，主要在花序莖中表達(dá)，在缺少次生木質(zhì)部的幼葉和花等器官中微弱表達(dá)[22]。本研究通過(guò)熒光定量PCR分析不同發(fā)育階段亞麻L(zhǎng)uCesA8基因表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)亞麻植株進(jìn)入快速生長(zhǎng)期（BBCH32）時(shí)，該基因表達(dá)量最高，該發(fā)育時(shí)期正是亞麻纖維細(xì)胞啟動(dòng)次生細(xì)胞壁加厚階段，當(dāng)亞麻進(jìn)入開(kāi)花期（BBCH65）和綠熟期（BBCH78），LuCesA8基因表達(dá)量再次上調(diào)，此時(shí)次生細(xì)胞壁進(jìn)一步加厚，纖維素沉積，纖維逐漸成熟，由此確定LuCesA8基因與亞麻次生細(xì)胞壁加厚密切相關(guān)。LuCesA8基因在亞麻次生細(xì)胞壁形成中的功能鑒定尚待深入研究。本研究可為闡明亞麻次生細(xì)胞壁中纖維素合成機(jī)理提供參考依據(jù)。

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Cloning and expression analysis of the cellulose synthase geneLuCesA8 in flax

/YU Ying1,2,GUO Wendong3,ZHAO Lijuan1,4,WU Jianzhong2,CHENG Lili2, ZHAO Dongsheng2,HU Yingying2,WU Guangwen2,GUAN Fengzhi1,2,YUAN Hongmei1,2(1.Postdoctoral Workstation,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;2.Institute of Industrial Crops,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China;3.Institute of Nature and Ecology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China;4.Institute of Crop Breeding,HeilongjiangAcademy ofAgricultural Sciences,Harbin 150086,China)

The total RNA extracted from flax stems at the stage of rapid growth was used for RT-PCR, then the full-length Open Reading Frame(ORF)sequence ofLuCesA8(Gene ID:Lus10029245)was amplified.The sequence analysis showed that the full-length ORF ofLuCesA8 consisted of 2 967 bp, encoding 988 amino acids.Homology analysis of the deduced amino acid showed 86%,85%,85%,81% identity to CesA8 fromPopulus trichocarpa,Theobroma cacao,Gossypium raimondiiandSesamum indicum,respectively.The qRT-PCR result revealed that the expression level of the gene was low at seedlingstage,and relatively higher at flowering and maturity stage,this gene expressed the highest level at the stage of rapid growth.This study provided a foundation for further research ofLuCesA8 biological function in the process of cellulose synthesis of the secondary cell wall.

flax;cellulose synthase;clone;expression analysis

S563.2；Q785

A

1005-9369（2016）08-0039-07

2016-05-14

哈爾濱市科技局創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2013RFQYJ162）；黑龍江省博士后項(xiàng)目（LBH-Z13181）；國(guó)家博士后面上項(xiàng)目（2014M560275）

于瑩（1981-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)閬喡檫z傳育種。E-mail:yuying_1981_0451@163.com

袁紅梅，副研究員，博士，研究方向?yàn)閬喡檫z傳育種。E-mail:yuanhm1979@163.com