王靚靚，張?艷，白會(huì)新?

（1.?大慶市畜牧獸醫(yī)局，黑龍江?大慶?163311；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江??齊齊哈爾??161000）

豬流行性腹瀉病毒的特性研究

王靚靚1，張?艷2，白會(huì)新1

（1.?大慶市畜牧獸醫(yī)局，黑龍江?大慶?163311；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江??齊齊哈爾??161000）

豬流行性腹瀉（porcine?epidemic?diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV）?引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。對于大多數(shù)的病毒性腹瀉疾病來說，防治措施一般選擇疫苗免疫。近年來，有關(guān)豬流行性腹瀉病毒疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，包括滅活疫苗、弱毒疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、乳酸桿菌疫苗、亞單位疫苗和聯(lián)合疫苗等。實(shí)驗(yàn)參照2010年版《中華人民共和國獸藥典》第3部的要求對該病毒的特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究與記錄，為PEDV?HLJBX株可作為弱毒疫苗候選株的研究提供了進(jìn)一步的參考資料。

豬流行性腹瀉病毒；種毒；疫苗

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）?引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病的特征是可以導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、脫水，并且致死率極高。實(shí)驗(yàn)室常用微量血清中和試驗(yàn)［1］、免疫電鏡法（IEM）［2］、免疫熒光法（FAT）［3］、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）［4］、雙抗體夾心ELISA［5］、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）［6］和RT-LAMP技術(shù)［7］等技術(shù)手段檢測該病。本文參照《中華人民共和國獸藥典》2010年版第3部的要求，通過對PEDV?HLJBX毒株的純粹檢查、滴度的測定和理化特性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究記錄，為下一步疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)材料

1.1毒株、細(xì)胞系和引物

PEDV?HLJBX株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離并保存，非洲綠猴傳代腎細(xì)胞（Vero）細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室保存。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）鑒定引物均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并由博仕生物公司合成。

1.2試劑

DMEM培養(yǎng)液，犢牛血清，RNA提取試劑盒，PEDV陽性血清，鼠抗PEDV全病毒抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)抗體，葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（G.P）、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）和支原體培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室配制。

2?　實(shí)驗(yàn)方法

2.1種毒的純粹檢查

2.1.1無菌檢測

在已經(jīng)配好的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（G.P）中接種PEDV，每種培養(yǎng)基各接2只試管，每管l?mL。分別置于37?℃和25?℃條件下培養(yǎng)7?d，對照管接種無菌生理鹽水。每天觀察記錄結(jié)果。

2.1.2支原體檢測

在支原體半流體培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基中接種PEDV種毒，每種培養(yǎng)基接種4支，每支0.5?mL。置?37℃培養(yǎng)14?d，每3?d觀察一次，陰性對照為生理鹽水，陽性對照為肺炎支原體。

2.1.3外源病毒檢驗(yàn)

按照提取總RNA和DNA試劑盒的說明提取種毒液的RNA和DNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物使用豬輪狀病毒（PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬圓環(huán)病毒（PCV）相應(yīng)上、下游引物及反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2.2種毒的理化特性

2.2.1熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取5管PEDV病毒，離心去細(xì)胞碎片，一管作為對照組放于4?℃，?保存30?min，其余4管分別置于37?℃、42?℃、50?℃、65?℃，30?min水浴，然后把實(shí)驗(yàn)組和對照組均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行TCID50測定。

2.2.2pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取2管PEDV，一管作為對照組，

另一管用HCl調(diào)至pH=3，37?℃作用1?h后，再調(diào)回pH為7.2～7.4，將對照組和實(shí)驗(yàn)組分別接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中，進(jìn)行TCID50測定。

2.2.3氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)

取2管PEDV，一管加入氯仿，使其終濃度為4.8%，振蕩混勻，2?500?r/?min離心5?min，取上清，另一管加DMEM作對照，測定兩組病毒的TCID50。

2.3種毒滴度的測定

采用96孔板進(jìn)行測定。首先將細(xì)胞進(jìn)行消化，分裝到96孔板內(nèi)，待細(xì)胞長滿80%時(shí)，棄去DMEM液，用PBS洗3次，將病毒稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-1010個(gè)稀釋度，每一稀釋度接種5孔細(xì)胞，接種量為100?μL/孔，并設(shè)立一行作為細(xì)胞對照，在接毒后72?h，判定細(xì)胞病變，當(dāng)病變細(xì)胞在80%以上時(shí)，判定為病變細(xì)胞孔，進(jìn)行TCID50的測定。按公式計(jì)算（Reed-Muech?氏法計(jì)算）。

表1　細(xì)菌和霉菌檢測結(jié)果

表2　PEDV支原體檢測結(jié)果

病毒稀釋度　孔數(shù)　　無CPE孔數(shù)有CPE孔數(shù)　　累計(jì)總數(shù)　CPE孔比例　　出現(xiàn)CPE率/% 無CPE孔　　有CPE孔10-1　5　0　5　0　28　28/28　100 10-2　5　0　5　0　23　23/23　100 10-3　5　0　5　0　18　18/18　100 10-4　5　0　5　0　13　13/13　100 10-5　5　0　5　0　8　8/8　100 10-6　5　2　3　2　3　3/5　60 10-7　5　5　0　7　0　0/7　0 10-8　5　5　0　12　0　0/12　0 10-9　5　5　0　17　0　0/17　0 10-10　5　5　0　22　0　0/22　0接種細(xì)胞

3　結(jié)果與分析

3.1細(xì)菌和霉菌檢測結(jié)果

對PEDV種毒進(jìn)行檢測，未見細(xì)菌、霉菌污染（見表1）。

3.2支原體檢測結(jié)果

用以下2種培養(yǎng)基對PEDV種毒進(jìn)行檢測，均未見支原體污染（見表2）。

3.3外源病毒檢測結(jié)果

對PRV、PRRSV、TEGV、PPV 和PCV的檢測結(jié)果，全部呈陰性，證明PEDV沒有這幾種外源病毒的污染（見圖1）。

3.4理化特性結(jié)果

3.4.2熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

病毒在50?℃及以上溫度處理30?min就會(huì)失去感染細(xì)胞的能力，滴度大幅度下降，而37?℃下作用30?min對病毒滴度沒有影響（見圖2）。

3.4.2pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將PEDV的pH調(diào)至3時(shí)，病毒的滴度變化不大，說明PEDV的PH較為穩(wěn)定（見圖3）。

圖1　外源病毒的檢測

圖2　PEDV熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖4　PEDV的氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)

3.4.3氯仿敏感性實(shí)驗(yàn)

加入終濃度為4.8%的氯仿，實(shí)驗(yàn)組的TCID50與對照組的對數(shù)差值大于2，表明PEDV對氯仿敏感（見圖4）。

3.5種毒庫病毒滴度的測定

采用96孔板進(jìn)行測定，在接毒后72?h，判定細(xì)胞病變，當(dāng)病變細(xì)胞在80%以上時(shí)，判定為病變細(xì)胞孔，進(jìn)行TCID50的測定。按公式計(jì)算（Reed-Muech?氏法計(jì)算），結(jié)果見表3。

其確切稀釋倍數(shù)可按下列公式計(jì)算：

將由上式獲得的0.17加在高于?50%死亡的稀釋度的對數(shù)（6）上，因此該病毒的?TCID50應(yīng)是10-6.17/0.1?mL。

4　討論

隨著PED在許多國家的暴發(fā)，很多國內(nèi)外學(xué)者都一直在研究PEDV的培養(yǎng)特性，希望可以通過PEDV的體外培養(yǎng)和PEDV感染細(xì)胞受體等多方面的研究來進(jìn)行PEDV的大量繁殖，可以為PEDV的疫苗研制提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。有報(bào)道稱適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的PEDV 經(jīng)60?℃或以上處理30?min失去感染力，但在50℃條件下相對穩(wěn)定，病毒在4?℃、pH?5.0～9.0以 及37?℃、pH?6.5～7.5時(shí)穩(wěn)定，經(jīng)超聲波處理或多次反復(fù)凍融后，病毒感染力不受影響，這些都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Kusanagi等［8］報(bào)道PEDV?對乙醇和氯仿敏感。這些研究成果只是一部分PEDV毒株的理化特性，并沒有針對性。本實(shí)驗(yàn)通過對PEDV?HLJBX毒株的理化特性的研究顯示，PEDV對熱敏感，若在50?℃溫度下作用30?min，就會(huì)失去了感染力，可達(dá)到熱滅活的效果。pH穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，病毒的滴度變化不大。

［1］?鄧芳.豬流行性腹瀉預(yù)防及診斷研究進(jìn)展［J］.畜禽業(yè)，2015?（3）：19-20.

［2］?照日格圖，李志國，王振普.?豬流行性腹瀉的診斷技術(shù)及預(yù)防策略［J］.北方牧業(yè)，2013?（13）：18.

［3］?林志雄，黃引賢，李樹根，等.應(yīng)用直接免疫熒光法檢測豬流行性腹瀉病毒的研究［J］.中國進(jìn)出境動(dòng)植檢，1997?（2）：32-34.

［4］?華耀，王瑋，李郁，等.?豬流行性腹瀉病毒S蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立［J］.?微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（2）：434-443.

［5］?李一經(jīng)，劉博，姜艷平，等.?雙抗體夾心ELISA檢測排泄物PEDV［J］.?東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（2）：1-10.

［6］?孟凡偉，張雪，王俊，等.?豬流行性腹瀉病毒Real-time?PCR檢測方法的建立［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（5）：41-45.

［7］?LI?PREN?X.Reverse?transcription?loop-mediated?isothermal?amplification?for?rapid?detection?of?transmissible?gastroenteritis?virus［J］.Curr?Microbiol，2011，62（3）：1074-1080.

［8］?KUSANAGI?K，KUWAHARAR?H，KATOH?T，et?al.Isolation?and?serial?propagation?of?porcine?epidemic?diarrhea?virus?in?cell?cultures?and?partial?characterization?of?the?isolate［J］.Vet?Med?Sci，1992，54（2）：313-318.

2016-04-08）

黑龍江省教育廳新世紀(jì)優(yōu)秀人才基金資助項(xiàng)目（1155-NCET-005）；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)基

金資助項(xiàng)目（2011TD001）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31201911；31200122）

王靚靚（1987-），女，獸醫(yī)碩士，獸醫(yī)師，主要從事工作：動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督和疫病防控

白會(huì)新