徐小惠，魯衍強，李　瑛，賈文靜，楊　琦

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湖北省英山縣漢族女性MTHFR和MTRR的遺傳多態(tài)性分析

徐小惠1，魯衍強2，李瑛2，賈文靜2，楊琦3

(1.湖北省黃岡市英山縣婦幼保健院，湖北 黃岡438700；2.上海靶向分子醫(yī)學(xué)研究所，上海200433；3.中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心，北京100101)

目的分析湖北省黃岡市英山縣漢族育齡女性葉酸代謝相關(guān)酶5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)的基因多態(tài)性分布特征，以指導(dǎo)育齡女性增補葉酸和出生缺陷的一級預(yù)防。方法以英山縣319例漢族女性為研究對象，提取口腔黏膜上皮細胞基因組DNA，通過熒光定量PCR法對MTHFR和MTRR的多態(tài)性位點進行分析，獲得英山縣婦女該基因的分布特征，并與已報道的其他地區(qū)的數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果英山縣漢族女性MTHFR C677T基因型構(gòu)成與淄博、濟源、張家口、延邊、烏魯木齊、銀川、眉山、南寧、瓊海數(shù)據(jù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值為181.41～13.46，均P<0.05)，與松滋、湘潭、惠州相比無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值為0.12～5.87，均P>0.05)。英山縣漢族女性MTHFR A1298C基因型構(gòu)成與淄博、濟源、張家口、延邊、銀川、眉山、松滋、湘潭數(shù)據(jù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值為76.94～7.31，均P<0.05)，與烏魯木齊、惠州、南寧、瓊海相比無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值為5.19～0.97，均P>0.05)。英山縣漢族女性MTRR A66G的基因型構(gòu)成與延邊和瓊海的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為6.10、17.10，均P<0.05)，與淄博、濟源、張家口、烏魯木齊、銀川、眉山、松滋、湘潭、惠州、南寧的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值為0.95～5.48，均P>0.05)。結(jié)論英山縣漢族女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性頻率分布具有地域特異性。

亞甲基四氫葉酸還原酶；甲硫氨酸合成酶還原酶；基因多態(tài)性

[Abstrac]Objective To explore the genotype distribution of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methyltransferase reductase (MTRR) involved in folic acid biosynthetic pathway among Chinese Han gestational age women in Yingshan City in Hubei Province, so as to guide folic acid supplement and primary prevention of birth defects. Methods Genomic DNA was obtained from the oral mucosa cells of 319 females in Han nationality in Yingshan City, and PCR method was used to analyze MTHFR and MTRR gene polymorphisms and obtain distribution of gene polymorphisms. They were compared with the reported data of other regions in China. Results The genotype distribution of MTHFR C677T among Yingshan women was significantly different to that among women in Zibo, Jiyuan, Zhangjiakou, Yanbian, Urumchi, Yinchuan, Meishan, Nanning and Qionghai (χ2value ranged 181.41-13.46, respectively, allP<0.05), but it was not significantly different to that in Songzi, Xiangtan and Huizhou (χ2value ranged 0.12-5.87, respectively, allP>0.05). The genotype distribution of MTHFR A1298C among Yingshan women was significantly different to that in Zibo, Jiyuan, Zhangjiakou, Yanbian, Yinchuan, Meishan, Songzi and Xiangtan (χ2value ranged 76.94-7.31, respectively, allP<0.05), but it was not significantly different to Urumchi, Huizhou, Nanning and Qionghai (χ2value ranged 5.19-0.97, respectively, allP>0.05). The genotype distribution of MTRR A66G among Yingshan women was significantly different to Yanbian and Qionghai (χ2value was 6.10 and 17.10, respectively, bothP<0.05), while there was no significant difference to Zibo, Jiyuan, Zhangjiakou, Urumchi, Yinchuan, Meishan, Songzi, Xiangtan, Huizhou and Nanning (χ2value ranged 0.95-5.48, respectively, allP>0.05). Conclusion The polymorphism frequency distribution of MTHFR and MTRR in Han women in Yingshan City is region specific.

[Key words]methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR); methyltransferase reductase (MTRR); polymorphism

近年來研究表明，葉酸代謝障礙及高同型半胱氨酸血癥不僅與胎兒出生缺陷密切相關(guān)，也可影響到心血管等方面的疾病，而5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene￣tetrahydrofolate reductase，MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methyltransferase reductase，MTRR)是參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，Nishio等于2008年研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因多態(tài)性會影響體內(nèi)葉酸及同型半胱氨酸水平，并且其分布有民族以及地域間的差異。本研究針對英山縣漢族育齡女性開展大樣本的分子流行病學(xué)調(diào)查，對該人群的基因多態(tài)性分布進行統(tǒng)計分析，旨在闡明本地區(qū)人群的遺傳特征，為個體化的孕期保健提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究對象

選擇2014年7月至2015年4月在英山縣婦幼保健院就診的漢族女性為研究對象，經(jīng)患者知情同意，采集口腔黏膜細胞進行遺傳檢測。排除非英山縣人群以及標本不合要求者。共獲取有效樣本319例，患者平均年齡26.53±5.43歲。

1.2研究方法

用棉拭子采集患者的口腔黏膜細胞，采用柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取樣本DNA。Taqman-MGB探針熒光定量PCR檢測MTHFR C677TA1298C和MTRR A66G的基因多態(tài)性。相關(guān)儀器、試劑均購于美國ABI公司。每個反應(yīng)體系總體積10μL，包含濃度為20ng/μL的DNA模板1μL,2 x Taqman Universal MasterMix 5μL,20 x Taqman-MGB探針0.5μL，去離子水3.5μL。反應(yīng)條件為95℃10min，隨后進行20個循環(huán)的擴增(92℃15s，60℃1min)，再進行30個循環(huán)的擴增(89℃15s，60℃90s)。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用Haplo View4.2軟件進行SNPs的Hardy-Weinberg平衡、連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)水平和單倍型結(jié)構(gòu)分析。計數(shù)資料采用率表示，對基因型及等位基因頻率進行χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1英山縣漢族育齡女性MTHFR、MTRR基因多態(tài)性的分析

對檢測到的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點分別進行遺傳平衡檢驗，均符合H-W遺傳平衡檢驗，證明樣本具有本區(qū)域的代表性。

2.2 MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率在不同地區(qū)漢族女性中的比較

2.2.1英山縣漢族女性 MTHFR、MTRR基因型分布

英山縣漢族女性MTHFR C677T基因型構(gòu)成與淄博、濟源、張家口、延邊、烏魯木齊、銀川、眉山、南寧、瓊海數(shù)據(jù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，與松滋、湘潭、惠州相比無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。 英山縣漢族女性MTHFR A1298C基因型構(gòu)成與淄博、濟源、張家口、延邊、銀川、眉山、松滋、湘潭數(shù)據(jù)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，與烏魯木齊、惠州、南寧、瓊海相比無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。英山縣漢族女性MTRR A66G的基因型構(gòu)成與延邊和瓊海的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，與淄博、濟源、張家口、烏魯木齊、銀川、眉山、松滋、湘潭、惠州、南寧的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

2.2.2英山縣漢族女性MTHFR、MTRR等位基因頻率分布

英山縣漢族女性的MTHFR 677T等位基因頻率顯著低于淄博、濟源、張家口、延邊、銀川、烏魯木齊、眉山、惠州、南寧、瓊海(均P<0.05)，與松滋、湘潭無顯著性差異(均P>0.05)。MTHFR 1298C等位基因頻率顯著高于淄博、濟源、張家口、延邊、銀川、烏魯木齊、松滋、眉山、湘潭(均P<0.05)，與惠州、南寧和瓊海無顯著性差異(均P>0.05)。MTRR 66G等位基因頻率顯著低于瓊海(P<0.05)，但與張家口、湘潭、松滋、烏魯木齊、惠州、眉山、延邊、銀川、南寧、濟源、淄博的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表1　不同地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)和頻率分布比較[n(%)]

注：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表2　不同地區(qū)漢族女性MTHFR、MTRR等位基因頻數(shù)和頻率分布比較[n(%)]

注：＊P<0.05，＊＊P<0.01。

2.3 MTHFR基因677、1298位點連鎖情況及單倍型分析

MTHFR C677T和A1298C兩位點組合情況見表3。用現(xiàn)有數(shù)據(jù)對英山縣漢族女性MTHFR基因677C/T與1298A/C兩位點構(gòu)建單倍型，發(fā)現(xiàn)在這一群體中主要以677C-1298A(40.10%)和677T-1298A(34.40%)兩種組合形式存在，還有部分677C-1298C(25.30%)以及少量677T-1298C(0.30%)類型。經(jīng)連鎖不平衡分析，本縣漢族女性人群677與1298兩位點間存在強連鎖不平衡現(xiàn)象(D'=0.97)。

表3MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布[n (%)]

Table 3　Linkage distribution of MTHFR C677T and A1298C[n (%)]

3討論

3.1 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶與出生缺陷的關(guān)系

葉酸是一種水溶性維生素，廣泛存在于綠色蔬菜與水果中，是四氫葉酸的主要成分，四氫葉酸作為細胞生化反應(yīng)中甲基的主要供應(yīng)者，參與嘌呤與嘧啶的合成及HCY向蛋氨酸轉(zhuǎn)化中的甲基反應(yīng)。而MTHFR、MTRR則為葉酸-甲硫氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其基因位點突變可引起相應(yīng)的酶活性降低，從而引起葉酸和甲硫氨酸代謝障礙，最終造成葉酸吸收的下降以及HCY在人體內(nèi)蓄積。

MTHFR上的C677T、A1298C位點的基因型發(fā)生突變，會導(dǎo)致MTHFR的酶活性及熱穩(wěn)定性下降，TT基因型對應(yīng)的酶活性下降到正常的22%。MTHFR 677CT和1298AC存在協(xié)同作用，會導(dǎo)致對應(yīng)的酶活性下降到正常的36%。MTRR 66AA基因型與66GG基因型相比，個體發(fā)生神經(jīng)管畸形風(fēng)險增加2.6倍 (OR=2.6，95%CI= 1.3～5.3) 。這3個基因位點的突變均為錯義突變。

隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的進步和孕期葉酸補充等措施的實施，近年新生兒出生缺陷發(fā)病率雖然有所降低，但每年新發(fā)生出生缺陷仍高達90萬例，因此，通過對育齡女性進行遺傳篩查，即MTHFR和MTRR多態(tài)性檢測，針對存在葉酸代謝障礙的遺傳風(fēng)險人群，采取相應(yīng)干預(yù)措施，已成為有效達到出生缺陷及孕期疾病一級預(yù)防目的的重要方法。

3.2 英山及全國葉酸代謝基因位點多態(tài)性

英山縣女性易感基因MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點多態(tài)性與其他地區(qū)漢族女性的頻率存在差異。MTHFR 677T等位基因頻率呈現(xiàn)北方高南方低的趨勢，與我國出生缺陷發(fā)病率北方高南方低的趨勢一致。研究表明，T基因型孕齡女性在低葉酸飲食及未服用葉酸增補劑的情況下，其胎兒唇腭裂的發(fā)生風(fēng)險均會增加，若以上兩種情況同時存在，則風(fēng)險進一步增高。反之，如果能夠補服葉酸增補劑、提高飲食中葉酸的含量則可以降低胎兒唇腭裂的發(fā)生風(fēng)險[13]。

3.3多態(tài)性研究的重要性

MTHFR C677T基因多態(tài)性與神經(jīng)管畸形的關(guān)系已有大量證據(jù)證明，葉酸增補預(yù)防神經(jīng)管畸形是20世紀公共衛(wèi)生領(lǐng)域取得的最重要成果之一。但是，由于受教育程度、醫(yī)療資源、飲食環(huán)境等地域性差異的限制，我國貧困地區(qū)葉酸增補依從性依然較低，因此以神經(jīng)管畸形為主的出生缺陷仍呈高發(fā)態(tài)勢[14]，進一步的健康教育和預(yù)防措施(葉酸增補)仍然十分重要。通過對育齡女性進行遺傳篩查，針對存在葉酸代謝障礙的遺傳風(fēng)險人群，采取增加營養(yǎng)素補充、加強紅細胞葉酸水平監(jiān)測、提高產(chǎn)前篩查和孕期管理依從性等干預(yù)措施，是有效達到出生缺陷及孕期疾病一級預(yù)防目的的重要方法，也是提高人口素質(zhì)的必要手段。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：游川]

Gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and methionine synthase among Han gestational age women in Yingshan City in Hubei Province

XU Xiao-hui1, LU Yan-qiang2, LI Ying2, JIA Wen-jing2, YANG Qi3

(1.Maternal and Child Health-care Hospital of Yingshan City, Hubei Huanggang 438700, China;2. Institute of Targeted Therapy and Molecular Medicine of Shanghai, Shanghai 200433, China;3.National Center for Women and Children’s Health, China CDC, Beijing 100101, China )

2015-06-15

徐小惠(1974-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦女保健工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.02.036

R715.5

A

1673-5293(2016)02-0252-04