王　聰,楊恒山,董永義,馬玉露,賈俊英,包金花,鄭　毅

(內蒙古民族大學 農學院,內蒙古 通遼　028042)

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NaCl脅迫下外源殼聚糖對菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧代謝的影響

王聰,楊恒山,董永義,馬玉露,賈俊英,包金花,鄭毅

(內蒙古民族大學 農學院,內蒙古 通遼028042)

外源殼聚糖;NaCl脅迫;光合作用;葉綠體活性氧代謝

鹽脅迫已成為引起植物產量和品質下降的一種主要的非生物脅迫類型,提高植物的耐鹽性已成為當前亟待解決的問題。殼聚糖(Chitosan,CTS) 是脫乙?；蟮玫降木郯被咸烟?是一種可再生、廉價、清潔的化學物質,而且是一種有效的非生物脅迫抗性誘導劑[1～5]。研究表明,外源殼聚糖可通過提高抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質的含量,有效阻止辣椒體內丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)的積累,緩解水分脅迫對辣椒幼苗造成的膜脂過氧化,增強辣椒幼苗的抗旱性[3]。鹽脅迫下,殼聚糖通過提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性,降低MDA含量和電解質滲出率,進而促進了豇豆幼苗的形態(tài)建成[5]。高溫脅迫下,外源殼聚糖顯著提高了蝴蝶蘭幼苗葉片SOD、POD及過氧化氫酶(CAT)活性和可溶性糖、葉綠素和類胡蘿卜素含量,顯著降低了質膜透性及MDA含量,進而提高了蝴蝶蘭幼苗的耐熱性[6]。

盡管就外源殼聚糖緩解逆境脅迫前人已做了大量研究,但殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧(ROS)代謝有何影響，是否可阻止/緩解鹽脅迫對其造成的傷害，尚未見報道。2013年通過預備試驗發(fā)現外源殼聚糖可延緩鹽脅迫對菜用大豆生長的抑制作用,并篩選出了殼聚糖處理的適宜濃度為200 mg/L,在此基礎上,本試驗以苗期菜用大豆為研究對象,用殼聚糖溶液噴施幼苗葉片,探討NaCl脅迫下殼聚糖對菜用大豆光合作用及葉綠體活性氧代謝的影響,旨在探明外源殼聚糖調控菜用大豆光合作用的生理機制,以期為殼聚糖作為抗鹽劑的開發(fā)應用提供參考依據。

1　材料和方法

1.1植物材料準備

菜用大豆(Glycinemax(L.) Merr.)品種選用主栽品種理想高產95-1,試驗于2014年4月6日在內蒙古民族大學試驗基地日光溫室內進行。干種子直播于上直徑25 cm、下直徑15 cm、高20 cm的塑料盆中,蛭石作基質,澆灌日本園試[7]營養(yǎng)液,每盆定苗4株。真葉展開后每3 d澆1/4濃度日本園試營養(yǎng)液1次,每盆澆液0.5 L。

1.2CTS誘導及NaCl處理

試驗設如下處理:對照(CK):葉面噴灑清水,根部澆灌營養(yǎng)液;處理1 (T1):葉面噴灑CTS溶液,根部澆灌營養(yǎng)液;處理2 (T2):葉面噴灑清水,根部澆灌溶有NaCl的營養(yǎng)液;處理3 (T3):葉面噴灑CTS溶液,根部澆灌溶有NaCl的營養(yǎng)液。每處理10盆,3次重復。NaCl脅迫的適宜濃度為100 mmol/L[8];CTS處理的適宜濃度為200 mg/L。

2片真葉完全展開后,用手持小型噴霧器將CTS溶液均勻噴灑在幼苗葉片的正面和背面,以量足但不下滴為宜,對照和處理3噴灑清水。誘導處理5 d后進行NaCl處理,NaCl溶于1/4濃度日本園試營養(yǎng)液,均勻澆入處理2和處理3基質中,每3 d澆液一次,澆液量同上。對照和處理1僅澆營養(yǎng)液。

1.3測定項目及方法

NaCl處理0 d開始測定,以后每3 d測定一次,共測定6次。以第一片完全展開的三出復葉頂葉為測試對象。處理15 d(T2處理植株葉片出現明顯褪綠、黃化癥狀)后測幼苗干質量。

光合參數:用GFS-3000光合儀(德國WALZ公司生產)于上午9:00-11:30測定。氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)及凈光合速率(Pn)由光合測定系統直接讀出。測定過程中光強約為800 μmol/(m2·s),大氣溫度為(25±2) ℃,大氣CO2濃度為(487±10) μmol/L。每次測定重復10次。

葉綠體制備:參照孫錦[9]的方法提取,在Takeda等[10]的基礎上略作改動。10 g去葉脈的新鮮葉片加20 mL提取緩沖液(50 nmol/L、pH值6.1的MES,含0.33 mol/L山梨糖醇,10 mol/L NaCl,2 mol/L MgCl2,2 mol/L EDTA,0.5 mol/L KH2PO4,2 mol/L AsA-Na,AsA-Na使用前現配現加)快速研磨,使葉片碎成綠豆粒大小,4層紗布過濾,濾液3 300 r/min離心3 min,倒出上清液,沉淀用1 mL提取緩沖液漂洗表面懸浮物;然后用1 mL懸浮液(50 mmol/L、pH值7.6的HEPES,含0.33 mmol/L山梨糖醇,10 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2,2 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L AsA-Na,AsA-Na使用前現配現加)將沉淀懸浮。為保證葉綠體純度,用Percol試劑進行梯度離心,完整率可達90%。

1.4數據處理

應用SPSS分析軟件對試驗數據進行統計分析。

2　結果與分析

2.1殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆干質量的影響

圖1顯示,NaCl脅迫15 d后,菜用大豆經T1處理后的干質量與對照無顯著差異;T2處理使其干質量較對照顯著降低,降幅為28%,T3處理使其干質量較T2的增幅達15%。表明NaCl脅迫顯著抑制了菜用大豆干質量的增加,外源殼聚糖可緩解鹽脅迫對其生長的抑制作用;無鹽條件下,外源殼聚糖對菜用大豆干質量的誘導作用不顯著。

不同小寫字母表示差異顯著(P<5%)。圖2-10同。

2.2殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆光合作用的影響

2.2.1對凈光合速率(Pn)的影響由圖2可知,T1處理使第0,3天(噴施殼聚糖第5,8天)時的Pn顯著高于對照,增幅分別為18%，30%,之后未見顯著影響。T2條件下,第3天時的Pn與對照無顯著差異,隨著脅迫時間的延長,Pn受到了顯著抑制,較對照的降幅分別達37%，45%，51%，52%;T3處理第3天時其Pn維持在T2水平,第6，9，12天時較T2顯著增高,增幅分別為30%，56%，24%,至15 d時誘導作用消失,Pn又回落至T2水平。表明在NaCl脅迫和無鹽條件下,外源殼聚糖對菜用大豆的Pn均產生了顯著誘導作用,但無鹽條件下僅在前期產生影響。上述試驗結果也表明殼聚糖的作用具有時效性。

圖2　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆凈光合速率(Pn)的影響

2.2.2對氣孔導度(Gs)的影響圖3顯示,T1處理在第0,3天時的Gs均較對照顯著增高;經T2處理3 d后的Gs與對照無顯著差異,隨后均較對照顯著降低,降幅分別為14%,18%,28%,34%,T3處理并未對NaCl脅迫后的Gs產生顯著影響。表明NaCl脅迫顯著抑制了菜用大豆的Gs,但殼聚糖未對其產生誘導作用。

圖3　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆氣孔導度(Gs)的影響

2.2.3對胞間CO2濃度(Ci)的影響T1處理后,菜用大豆在第0,3天時的Ci顯著高于對照;經T2處理后第6,15天時的Ci顯著高于對照,其余時期均維持在對照水平;與T2相比,T3處理第3,15天時的Ci無顯著變化,其余時期均顯著降低(圖4)。

圖4　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆胞間CO2濃度(Ci)的影響

2.3殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體活性氧代謝的影響

圖5　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆產生速率的影響

2.3.2H2O2含量圖6顯示,T1處理使0,3 d時的H2O2含量顯著低于對照。T2條件下,H2O2含量在脅迫6～15 d期間均顯著高于對照,T3處理使該期間的H2O2含量較T2顯著降低,降幅分別為13%,13%,11%,11%,但均顯著高于對照。表明外源殼聚糖可抑制NaCl脅迫下葉綠體H2O2的產生;無鹽條件下,殼聚糖可顯著降低菜用大豆前期的H2O2含量。

2.3.3SOD活性由圖7可看出,T1處理顯著提高了0 d時的SOD活性;T2處理致使整個脅迫期間的SOD活性顯著下降,降幅分別為36%,16%,21%,49%,18%,T3處理顯著提高了各期SOD活性,其中第6天時顯著高于對照,其余時期均維持在對照水平?？梢娡庠礆ぞ厶秋@著誘導了NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體SOD活性;無鹽條件下只對早期SOD活性產生誘導作用。

2.3.4POD活性T1處理顯著提高了0,3 d時的POD活性;T2處理后,第3天時的活性未受顯著影響,隨后均較對照顯著下降,T3處理顯著提高了脅迫第6～15天期間的POD活性,其中第6,15天時達對照水平,第9,12天時顯著高于對照 (圖8)。

圖6　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體H2O2含量的影響

圖7　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體SOD活性的影響

圖8　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體POD活性的影響

2.3.5APX活性APX可以AsA為電子供體直接清除H2O2。圖9顯示,T1條件下的APX活性在第0,3天時均顯著高于對照;T2處理導致第6～15天期間的APX活性均較對照顯著降低,T3處理使脅迫第6,9,12天時的活性較T2顯著提高,但均顯著低于對照。表明外源殼聚糖對脅迫中期的APX活性產生了顯著誘導作用。

圖9　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體APX活性的影響

2.3.6GR活性GR催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原形成GSH,是AsA-GSH循環(huán)的關鍵酶。由圖10可看出,T1處理使第0,3天時的GR活性顯著升高;T2處理導致整個脅迫期間的活性均顯著降低;T3處理后GR活性的起伏較大,脅迫第3天時處于T2水平,之后大幅上升,第9天時達峰值,且第6,9天時的活性均顯著高于對照,之后又大幅下降,但第12,15天時的活性仍顯著高于T2。可見殼聚糖顯著誘導了NaCl脅迫中、后期的GR活性;無鹽條件下前期的GR活性受到顯著誘導。

圖10　殼聚糖對NaCl脅迫下菜用大豆葉綠體GR活性的影響

3　結論與討論

3.1NaCl脅迫下外源殼聚糖與光合參數

NaCl脅迫可通過影響葉綠素的合成、分解,光合相關酶活性,水分吸收,氣孔CO2擴散阻力等生理活動以及光合器官結構等,進而直接或間接影響光合作用。植物Pn變化的原因可分為氣孔因素(主要是受氣孔導度的影響)和非氣孔因素(受葉肉細胞光合活性的影響)。一般地,Pn、Gs和Ci均下降,則Pn的下降主要由氣孔限制引起;Pn和Gs下降,Ci上升或無顯著變化,則Pn的下降主要由非氣孔限制引起[11～15]。而通過誘導氣孔因素或非氣孔因素則可能提高Pn,或阻止、緩解Pn的下降。

本試驗結果顯示,NaCl脅迫下,菜用大豆在脅迫第6,15天時Pn、Gs顯著下降,Ci顯著升高;脅迫第9、12 d時Pn、Gs顯著下降,Ci無顯著變化,說明非氣孔限制是導致其Pn下降的主要原因。這與鹽脅迫條件下黑麥草[16]、玉米[17]等的結果相近。噴施殼聚糖后,菜用大豆在脅迫第6,9,12天時均表現為Pn較鹽處理顯著升高,Gs無顯著變化,Ci顯著下降,說明殼聚糖可通過誘導非氣孔因素顯著緩解Pn的下降;脅迫第3,15天時的Pn、Gs、Ci均與鹽處理無顯著差異,前者可能是由于脅迫早期菜用大豆的光合作用未受顯著影響,殼聚糖的誘導作用因此并未被激發(fā)所致,后者表明殼聚糖的作用具有時效性?？梢?NaCl脅迫下外源殼聚糖可通過誘導非氣孔因素來緩解菜用大豆Pn的下降,進而緩解鹽脅迫對其生長的抑制作用。

3.2NaCl脅迫下外源殼聚糖與葉綠體活性氧代謝

APX、GR是AsA-GSH循環(huán)的關鍵酶,其活性高低可直接影響AsA、GSH的氧化、還原速率,進而影響AsA-GSH循環(huán)的運轉速率及H2O2的清除效率。從本試驗結果來看,外源殼聚糖使NaCl脅迫中期(6～12 d)的APX活性及脅迫中、后期(6～15 d)的GR活性顯著升高?？梢娊浲庠礆ぞ厶钦T導,NaCl脅迫下AsA-GSH循環(huán)在清除葉綠體H2O2過程中發(fā)揮了積極作用。

3.3NaCl脅迫與無鹽條件下殼聚糖的誘導機制

試驗結果表明,外源殼聚糖是通過激活甲殼素誘導受體激酶1(Chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)機理發(fā)揮作用的[20]。當植物細胞感受到幾丁質時,細胞表面受體-CERK1通過其賴氨酸酸基(Lysine motif,LysM)直接與甲殼素結合(含胞外段),植物細胞膜上的CERK1通過胞外LysM結構域二聚化來完成配體感應,使其胞內結構域磷酸化并激活下游防衛(wèi)反應信號通路[21]?？梢?殼聚糖是通過直接作用于細胞膜系統來誘導植物防御反應的。NaCl脅迫下,植物體可通過Ca2+信號轉導、SOS信號傳導[22]、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯[23]等途徑傳導脅迫信號,進而誘導植物細胞發(fā)生一系列抗鹽生理反應。外源殼聚糖在NaCl脅迫下也可能是通過直接作用于膜系統進而誘導植物體抗鹽機制來發(fā)揮作用的。當菜用大豆在逆境下受到脅迫傷害時,外源殼聚糖可誘導其潛在的抗逆能力,調動抗逆協調機制,以阻止傷害或降低其傷害程度。本試驗中,無鹽條件下外源殼聚糖主要對菜用大豆前期光合作用及葉綠體活性氧代謝產生了顯著影響,與NaCl脅迫下的作用不同,可能是其啟動了不同的應答機制所致。

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Effects of Exogenous Chitosan on Photosynthesis and Chloroplast Reactive Oxygen Species Metabolism of Vegetable Soybean under NaCl Stress

WANG Cong,YANG Hengshan,DONG Yongyi,MA Yulu,JIA Junying,BAO Jinhua,ZHENG Yi

(College of Agronomy,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028042,China)

Exogenous chitosan;NaCl stress;Photosynthesis;Chloroplast reactive oxygen species metabolism

2016-06-27

國家自然科學基金項目(31260472;31260483)

王聰(1968-),男,內蒙古通遼人,教授,博士，碩士生導師,主要從事蔬菜生理和生物技術研究。

S643.01

A

1000-7091(2016)04-0162-06

10.7668/hbnxb.2016.04.026