毛玉梅,李　琴,付鳴佳,金華燕,沈俊良,鐘雪晴

(江西師范大學 生命科學學院,江西 南昌　330022)

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蛹蟲草CmKexin基因克隆和菌絲體中表達檢測

毛玉梅,李琴,付鳴佳,金華燕,沈俊良,鐘雪晴

(江西師范大學 生命科學學院,江西 南昌330022)

為了探討蛹蟲草類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)的表達特性,以真菌蛹蟲草菌絲體為研究對象,通過RT-PCR獲得蛹蟲草CmKexin基因的ORF序列,并進行序列分析。應用Northern雜交和Real-time PCR方法,檢測藍光照射后蛹蟲草菌絲體中CmKexin基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果獲得蛹蟲草CmKexin基因的ORF序列。對翻譯蛋白質(zhì)產(chǎn)物CmKexin進行生物信息學分析,表明該蛋白質(zhì)含1個屬蛋白轉(zhuǎn)化酶的肽酶S8家族功能域(143～429)和1個前體蛋白轉(zhuǎn)化酶P功能域 (514～600),符合真菌類枯草桿菌蛋白酶的特征。蛹蟲草菌絲體在黑暗預培養(yǎng)4 d后再藍光照射,Northern Blotting和Real-time PCR檢測均可得到相同的結(jié)果,即在持續(xù)的藍光照射48～50 h時,出現(xiàn)CmKexin基因的瞬時大量轉(zhuǎn)錄。而其他時間內(nèi)均未檢測到該基因的大量轉(zhuǎn)錄。試驗結(jié)果將為蛹蟲草類枯草桿菌蛋白酶的利用提供理論依據(jù)。

蛹蟲草;CmKexin基因;類枯草桿菌蛋白酶;Northern雜交;實時熒光定量PCR

枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)為一類芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌分泌的胞外絲氨酸蛋白水解酶,在其他生物中也廣泛存在類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)[1-5]。代表性的這類蛋白酶有人的弗林蛋白酶(Furin)[6-7]和釀酒酵母(Saccharomycescerivisiae)的Kexin蛋白[8]。其中從釀酒酵母中克隆獲得的KEX2基因,其編碼的蛋白質(zhì)稱為Kexin[8]。Kexin是一個蛋白質(zhì)前體加工酶,其催化結(jié)構(gòu)域與類枯草桿菌蛋白酶家族的催化結(jié)構(gòu)域相似,因此也可稱為類枯草桿菌蛋白酶前體蛋白轉(zhuǎn)換酶(Subtilisin-like pro-protein convertases,SPCs)。它專一性地切割Lys-Arg、Arg-Arg、Pro-Arg 的C 末端肽鍵[8-10],參與激活肽類激素、生長因子和病毒蛋白。類枯草桿菌蛋白酶都屬肽酶S8家族(Peptidase family S8)。肽酶S8家族成員含有由Asp、His和Ser出現(xiàn)的催化三聯(lián)體,是重要的絲氨酸肽酶家族。在國際蛋白酶數(shù)據(jù)庫Merops(http://merops.sanger.ac.uk/)的分類方法中,肽酶S8可以分為2個亞家族,即S8a亞家族和S8b亞家族。而來自于釀酒酵母的Kexin和人的Furin屬于S8b亞家族。

在多種真菌中發(fā)現(xiàn)有類枯草桿菌蛋白酶,由于這類蛋白酶具有絲氨酸蛋白酶活性,可催化水解蛋白質(zhì)前體而在真菌中有多方面的功能。Jacob-Wilk等[11]從栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)中克隆了一個Kexin基因(CpKex2),分析表明該真菌的Kex2蛋白影響其發(fā)育和毒力,體現(xiàn)在CpKex2基因的沉默突變株減弱了它的毒力,減少了有性孢子和無性孢子的產(chǎn)生,這都與Kex2的酶活性有關(guān)。在栗疫病菌中還發(fā)現(xiàn)了另外一個類枯草桿菌蛋白酶Prb1,它也與該真菌的毒力有關(guān),同時還影響該真菌的表型[12]。Wang等[13]對煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)中的kexB基因(Kexin基因的另一種表示)進行了研究,該基因與該真菌的生長遲滯、溫度敏感的細胞壁缺陷、分生孢子的減少和異常的極性有關(guān)。其原因是kexB基因影響N-聚糖的加工,影響MpkA依賴的細胞壁整合(Cell wall integrity,CWI)信號途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER-stress)。在米曲霉中kexB基因也影響到細胞壁中的α-1,3-葡聚糖(α-1,3-glucan)的合成[14]。在光滑念珠菌(Candidaglabrata)中,kex2基因的突變株對幾種作用目標為細胞膜的抗真菌藥物高度敏感[15]。也有人從真菌木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)中得到了一個可用于染料脫色的類枯草桿菌蛋白酶,該酶可加入洗衣粉中使用,顯示了良好的工業(yè)生產(chǎn)前景[16]。目前,關(guān)于真菌中Kexin基因的研究多集中在菌絲體形成、細胞形態(tài)建成和真菌的毒力等方面的研究。

蛹蟲草(CordycepsmilitarisF411)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種生物活性成分,目前衛(wèi)生部已經(jīng)批準蛹蟲草為新資源食品。因此,有必要加深對蛹蟲草中相關(guān)基因調(diào)控的研究。藍光對真菌的形態(tài)發(fā)生和生理生化有重要的影響[17-21]。已確定組氨酸激酶的表達可受藍光的影響[22]。在前期的研究中,偶然克隆獲得了其中的類似Kexin基因部分片段,并在預備試驗中發(fā)現(xiàn)其與藍光也有一定的關(guān)系。通過探究藍光對蛹蟲草枯草桿菌蛋白酶基因表達的影響,可以為枯草桿菌蛋白酶基因在真菌中的研究提供參考依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

蛹蟲草菌株F411,由江西師范大學生命科學學院3411實驗室保存;TRIzol試劑和第一鏈cDNA合成試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司;Recombinant DNase Ⅰ、pMD18-T載體和TaqDNA聚合酶為寶生物(大連)工程有限公司產(chǎn)品;地高辛(Dig)標記試劑盒Ⅰ和Northern雜交試劑盒為深圳萊伯克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;尼龍膜購自美國PerkinElmer公司;SYBR Green PCR master mix購自美國Applied Biosystems公司;所有引物合成及測序均由Invitrogen公司完成。

1.2儀器與設(shè)備

S1000TMthermal cycler Chassis型 PCR擴增儀為美國伯樂(Bio-Rad)公司產(chǎn)品;實時熒光定量PCR儀,ABI StepOne Real-Time PCR System為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品;D-37520 Osterode型臺式高速離心機為美國Thermo公司產(chǎn)品;DYY-12型電泳儀和DYCp31D型水平電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3試驗方法

1.3.1蛹蟲草菌絲體的藍光照射培養(yǎng)和取樣蛹蟲草菌絲體接種在添加1%奶粉的PDA培養(yǎng)基上,在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。先用錫鉑紙包裹平板黑暗培養(yǎng)4 d后去除錫鉑紙進行持續(xù)的藍光光照培養(yǎng),并在設(shè)定照射時間后迅速置于-80 ℃冰凍,留待以后提總RNA。預備試驗已確定最長藍光光照時間為72 h。

1.3.2蛹蟲草菌絲體總RNA提取與cDNA第一鏈合成-80 ℃冰凍樣品取出后,刮取約0.1 g菌絲體在預冷的研砵中充分研磨。按照TRIzol試劑及第一鏈cDNA合成試劑盒生產(chǎn)廠家說明書,完成菌絲體總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成。

1.3.3蛹蟲草CmKexin基因開放閱讀框(ORF)的PCR擴增根據(jù)NCBI上查找到的相關(guān)蛹蟲草基因組序列CordycepsmilitarisCM01 whole genome shotgun sequence contig247(GenBank Accession No.AEVU01000247.1)[23],開放閱讀框使用軟件ORF finder尋找完成,系列引物設(shè)計使用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件完成(表1)。將2 μL cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入到25 μL的PCR反應體系中。整個PCR擴增的程序為:94 ℃預變性3 min;而后94 ℃變性40 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min進行循環(huán),共30個循環(huán)。將所獲得的PCR產(chǎn)物進行測序。

表1　PCR擴增中的引物

1.3.4探針(Dig-DNA)制備及Northern雜交檢測將提取總RNA在含有1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠上電泳,溴化乙錠(EB)染色檢測28S RNA和18S RNA的完整性。將瓊脂糖凝膠上的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,而后進行預雜交、雜交、洗膜,操作過程按地高辛雜交檢測試劑盒Ⅰ說明書進行,在洗膜后用堿性磷酸酶顯色法檢測目標條帶的存在。

1.3.5蛹蟲草CmKexin基因表達的Real-time檢測針對Real-time PCR設(shè)計擴增CmKexin基因引物HKYA:5′-CGACGGAGACGGAAACGAG-3′和HKYB:5′-GCAAGTAAAGGAGGTGGAGGG-3′。以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank Accession No.FJ374269.1)[24]為內(nèi)標基因,相應引物為G1:5′-GCCGAGGAAACAACAGAA-3′和G2:5′-GCAGTCGTGGCAAGGAT-3′。試驗中每個樣本的試驗組和內(nèi)參組各設(shè)3個重復,采用兩步法PCR擴增程序,即95 ℃預變性20 s；而后95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s進行循環(huán),共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用ΔCT 法:

目標基因/管家基因=2-ΔCT,ΔCT=CT目標基因-CT管家基因。

2　結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草中的RNA提取

蛹蟲草預先經(jīng)過黑暗培養(yǎng),而后再藍光照射處理以后,培養(yǎng)有蛹蟲草菌絲體的培養(yǎng)皿迅速置于-80 ℃,以保證在每次取樣時光照處理時間的準確。從圖1中可以看出所獲得的總RNA有2條清晰的28S和18S條帶,質(zhì)量較好。

2.2蛹蟲草CmKexin基因ORF的分段克隆測序和推測蛋白質(zhì)序列分析

2.2.1蛹蟲草CmKexin基因ORF序列分析共獲得了CmKexin基因ORF序列中的5段序列,即KX1為550 bp,KX2為650 bp,KX3為600 bp,KX4為1 200 bp,KX5為450 bp,這與設(shè)計片段長度一致(圖2)。利用DNAman軟件將上述序列拼接,獲得蛹蟲草CmKexin基因的ORF序列,全長為2 562 bp。Blast結(jié)果表明所獲得的CmKexin基因的ORF與C.militarisCM01 contig247序列中8 156～10 717 bp處同源。將獲得的CmKexin基因的ORF序列呈送NCBI,獲得GenBank Accession No.KC182793.1。

圖1　蛹蟲草菌絲體中提取的總RNA

M.Marker;1.由引物KXe1U 和KXe1D 擴增的KX1;2.由引物KXe2U和KXe2D擴增的KX2;3.由引物KXe3U和 KXe3D擴增的KX3;4.由引物KXe4U和KXe4D 擴增的KX4；5.由引物KXe5U和KXe5D 擴增的KX5。

M.Marker;1.PCR product KX1 amplified with KXe1U and KXe1D;2.PCR product KX2 amplified with KXe2U and KXe2D;3.PCR product KX3 amplified with KXe3U and KXe3D;4.PCR product KX4 amplified with KXe4U and KXe4D;5.PCR product KX5 amplified with KXe5U and KXe5D.

圖2蛹蟲草CmKexin基因ORF中部分序列的PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.2Electrophoresis of PCR products fromCmKexingene ORF partial sequence inC.militaris

2.2.2推測蛹蟲草CmKexin基因表達產(chǎn)物氨基酸序列分析使用DNAStar editseq的Translate功能,得到CmKexin基因翻譯產(chǎn)物CmKexin的推測氨基酸序列,長度為853 aa(GenBank Accession No.AGF91875.1)。運用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行分析,在CmKexin中包含1個屬于蛋白轉(zhuǎn)化酶的肽酶S8家族功能域(Peptidase S8 family domain in Protein convertases)(143～429)、1個前體蛋白轉(zhuǎn)化酶P功能域(Proprotein convertase P-domain)(514～600)和3個Ca2+結(jié)合位點。因此，推測此蛋白為類Kexin蛋白酶。

在CmKexin的肽酶S8家族功能域中,包含3個保守活性位點,分別是天冬氨酸(Asp)(185)、組氨酸(His)(223)和絲氨酸(Ser)(395)活性位點。另外，還有3個與蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性有關(guān)的Ca2+結(jié)合位點。CmKexin的催化結(jié)構(gòu)域與Kexin/Furin蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域相似,表明具有相似的功能。蛹蟲草CmKexin中含有保守的前體蛋白轉(zhuǎn)化酶P結(jié)構(gòu)域,有證據(jù)表明該結(jié)構(gòu)域主要參與調(diào)節(jié)催化結(jié)構(gòu)域的活性[25-26]。

2.2.3CmKexin蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域序列分析利用DNAman 軟件,將CmKexin的肽酶S8家族結(jié)構(gòu)域和原蛋白轉(zhuǎn)化酶P結(jié)構(gòu)域分別與5種真菌,即釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(NCBI Reference Sequnce NP_014161.1)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)(GenBank Accession No.EJP61353.1)、綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)(GenBank Accession No.EFY99205.1)、川地曲霉(Aspergilluskawachii)(GenBank Accession No.GAA81939.1)和麥角菌(Clavicepspurpurea)(GenBank Accession No.CCE32137.1)、1種細菌噬菌蛭弧菌Bdellovibriobacteriovorus(NCBI Reference Sequnce NP_967370.1)和1種動物小家鼠(Musmusculus,GenBank Accession No.CAA37988.1)中的類枯草桿菌蛋白酶中的相同功能域進行比對。

比對結(jié)果表明,CmKexin與這7種生物類枯草桿菌蛋白酶中的肽酶S8家族結(jié)構(gòu)域和原蛋白轉(zhuǎn)化酶P結(jié)構(gòu)域有較高的同源性,尤其是與真菌的同源性要高于與動物和細菌的同源性(表2、圖3)。在真菌中,CmKexin的這2個結(jié)構(gòu)域與同為蟲生真菌的球孢白僵菌的同源性最高。從CmKexin肽酶S8家族結(jié)構(gòu)域中可清楚看到含Asp、His和Ser殘基3個高度保守的區(qū)域,且除細菌稍有差異外,均出現(xiàn)在基序Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg 和Gly-Thr-Ser-Ala中(圖3)。根據(jù)分析結(jié)果可以確定Cmkexin為屬于絲氨酸蛋白酶S8b亞家族的蛋白轉(zhuǎn)化酶,其序列結(jié)構(gòu)與國際蛋白酶數(shù)據(jù)庫Merops(http://merops.sanger.ac.uk/)中的相關(guān)描述一致。

2.3蛹蟲草中CmKexin基因藍光誘導表達的Northern雜交檢測

2.3.1用于Northern雜交的探針合成CmKexin基因部分序列構(gòu)建在質(zhì)粒載體pMD18-T上,以該質(zhì)粒為底物,以KX1和KX4C為擴增引物,通過地高辛(Dig)標記試劑盒Ⅰ進行探針的合成。在特異性PCR擴增后,產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測到一條865 bp DNA條帶(圖4)。這樣目標DNA條帶標記上地高辛,將該DNA片段回收作為Northern雜交用的探針。

表2　CmKexin與不同物種間類枯草蛋白酶功能域的同源性

2.3.2CmKexin基因藍光誘導表達的Northern雜交檢測蛹蟲草菌絲體在黑暗中預培養(yǎng)4 d后快速放入藍光中照射處理。通過Northern雜交可以初步確定黑暗48,96 h的取樣中未見有雜交帶(圖5-1,8);進入藍光以后,光照1,4,8,12,24 h也均未檢測到雜交帶(圖5-7,6,5,4,3),只有光照48 h時才出現(xiàn)了1條雜交條帶(圖5-2)。

2.4蛹蟲草CmKexin基因表達的Real-time PCR檢測分析

根據(jù)2.3.2的試驗結(jié)果,設(shè)計Real-time PCR檢測藍光對CmKexin基因表達的影響。結(jié)果表明,當黑暗4 d(即進入藍光照射之前)CmKexin基因的相對表達量不是很明顯,進入藍光照射以后稍有一點下降,并維持在一個相對平穩(wěn)的低水平(圖6)。但從藍光照射的第48 h開始,CmKexin基因相對表達量有一個急劇的上升,并在第50 h達到了最高峰,而在56 h又回到原有水平(圖6)。這樣的結(jié)果和2.3.2的試驗結(jié)果相比較基本是一致的,這2個結(jié)果可互為印證。

3　討論

蛹蟲草中含有豐富的對人體有益的活性物質(zhì),已經(jīng)成為衛(wèi)生部批準的新資源食品。因此,弄清楚蛹蟲草中的生理生化活性成分非常重要。前期對蛹蟲草中的部分基因進行克隆的過程中,獲得了類似Kexin基因部分片段,預備試驗中發(fā)現(xiàn)其與藍光有一定的關(guān)系。在前期研究基礎(chǔ)上對該基因進行了克隆和測序,獲得類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶基因CmKexin。

A.肽酶S8家族結(jié)構(gòu)域比對;B.前體蛋白轉(zhuǎn)化酶P結(jié)構(gòu)域比對。

圖4　標記探針的電泳檢測結(jié)果

1.黑暗48 h;2.藍光處理48 h;3.藍光處理24 h;4.藍光處理12 h;5.藍光處理8 h;6.藍光處理4 h;7.藍光處理1 h;8.黑暗96 h。

1.Darkness treatment of 48 h;2.Blue light treatment of 48 h;3.Blue light treatment of 24 h;4.Blue light treatment of 12 h;5.Blue light treatment of 8 h;6.Blue light treatment of 4 h;7.Blue light treatment of 1 h;8.Darkness treatment of 96 h.

圖5蛹蟲草受藍光照射后CmKexin基因的Northern Blotting

Fig.5Northern Blotting analysis ofCmKexingene ofC.militarisin the continuous blue light irradiation

圖6　藍光處理后蛹蟲草中CmKexin基因表達的Real-time PCR檢測

通過PCR克隆了CmKexin基因的ORF序列,翻譯后可得到的蛋白質(zhì)CmKexin氨基酸序列長853 aa。在CmKexin中包含1個肽酶S8家族功能域和1個前體蛋白轉(zhuǎn)化酶P功能域,與酵母的Kexin蛋白有較高的同源性,也與其他真菌中類枯草桿菌蛋白酶這2個功能域有較高的同源性,初步表明CmKexin屬于S8b亞家族的前體蛋白轉(zhuǎn)化酶。CmKexin的催化結(jié)構(gòu)域中帶有明顯的Asp、His和Ser殘基的保守序列,可形成催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu),該特點在其他真菌的絲氨酸蛋白酶中也有出現(xiàn)[27]。

通過Northern 雜交檢測,CmKexin基因在藍光照射48 h時有較好的表達,而在其他時間段均沒有檢測到該基因的表達。通過實時熒光定量PCR對藍光照射處理后的蛹蟲草CmKexin基因表達進一步研究,無藍光照射和藍光照射的前48 h內(nèi)沒有檢測到CmKexin基因的表達,只在48 h后表達量急劇上升,并在50 h時達頂峰。該結(jié)果和Northern雜交檢測的結(jié)果基本一致,剔除人為因素的影響,這2個結(jié)果沒有太大出入。已經(jīng)初步確知CmKexin基因的產(chǎn)物為類枯草桿菌蛋白酶,而類枯草桿菌蛋白酶與某些初生蛋白質(zhì)合成過程中的成熟有關(guān)[7]。因此,推測在該時間段蛹蟲草中有一類蛋白質(zhì)的合成和成熟,并可能在成熟過程中主要由CmKexin基因的表達產(chǎn)物來加工。此外,已經(jīng)有研究表明某些真菌中的類枯草桿菌蛋白酶對一些真菌的菌絲體生長有抑制作用[28-30]。在研究中,觀察到蛹蟲草在藍光照射48 h以后,其菌絲體的生長開始變得緩慢,此時正是CmKexin基因的大量表達以后,相關(guān)結(jié)果還需要更多的研究結(jié)果進行支持。

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Clone of Gene CmKexin of Cordyceps militaris and Its Detection of Expression in Mycelium

MAO Yumei,LI Qin,FU Mingjia,JIN Huayan,SHEN Junliang,ZHONG Xueqing

(College of Life Sciences,Jiangxi Normal University,Nanchang330022,China)

In order to study the characteristics of subtilisin-like protease expression in the mycelia of fungusCordycepsmilitaris,CmKexingene ORF sequences ofC.militariswas got by RT-PCR,thenCmKexinsequence was analysed.The Real-time PCR and Northern Blotting were used to theCmKexingene expression analysis in theC.militarismycelia in blue light irradiation of different time.Results showed theCmKexingene ORF sequence was obtained fromC.militarismycelia.The bioinformatics analysis for the translation products ofCmKexingene showed that there were 1 peptidase S8 family domain of protein convertases (143-429) and 1 proprotein convertase P-domain(514-600) in the protein.The two domains existed in CmKexin demonstrate the characteristics of subtilisin-like protease.Under the dark pre-culture in 96 h,a large amounts of transcript ofCmKexingene in the mycelia could be detected by Northern Blotting and Real-time PCR in the continuous blue light irradiation to 48-50 hours.But the transcription ofCmKexingene wasn′t detected in the other time ofC.militarismycelia culture.These results would provide the basis for using the subtilisin-like protease inCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris;CmKexingene;Subtilisin-like protease;Northern Blotting;Real-time PCR

2016-04-26

國家自然科學基金項目(31060004;31260010)

毛玉梅(1989-),女,山東聊城人,在讀碩士,主要從事食用菌分子生物學研究。毛玉梅、李琴為同等貢獻作者。

付鳴佳(1964-),男,江西高安人,博士,教授,碩士生導師,主要從事食藥用真菌研究。

Q939.5;Q556+.3;Q78

A

1000-7091(2016)04-0112-07

10.7668/hbnxb.2016.04.019