賈新平,孫曉波,梁麗建,鄧衍明,蘇家樂(lè),周建濤

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京　210014)

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繡球SSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

賈新平,孫曉波,梁麗建,鄧衍明,蘇家樂(lè),周建濤

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京210014)

為了建立適合繡球的SSR-PCR反應(yīng)體系,采用正交設(shè)計(jì)L25(56)對(duì)影響SSR-PCR反應(yīng)體系的5個(gè)主要因素(Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化,篩選出每個(gè)因素的最佳水平,建立適合繡球的SSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明,20 μL的SSR-PCR反應(yīng)體系中,DNA模板用量為60 ng,Mg2+濃度為1.5 mmol/L,dNTPs濃度為0.3 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L,Taq聚合酶用量為0.8 U。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,最佳溫度退火40 s,72 ℃ 1 min,33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。選用10個(gè)繡球品種對(duì)建立的SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明該體系具有較好的穩(wěn)定性和通用性。建立和優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應(yīng)體系,為應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展繡球?qū)僦参镞z傳育種研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

繡球;SSR-PCR;正交設(shè)計(jì);反應(yīng)體系

繡球(Hydrangeamacrophylla)又稱八仙花、紫陽(yáng)花,是虎耳草科(Saxifragaceae)繡球?qū)?Hydrangea)植物,主要分布于亞洲東南部和南北美洲[1]。全世界繡球?qū)僦参锛s有73種,而我國(guó)是繡球?qū)僦参锏闹饕植贾行?現(xiàn)有47種和11個(gè)變種,約占世界資源的63%[2]。繡球的花序、花型、花色非常豐富,葉大而具有光澤,既可觀花又可觀葉,是世界園林中非常重要的觀賞植物。繡球在不良環(huán)境中表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力,具有耐蔭、耐寒、抗病蟲(chóng)害等優(yōu)良特性[3]。繡球不僅具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,還具有一定的藥用價(jià)值[4]。因此,繡球作為一種觀賞兼藥用的優(yōu)良觀賞植物,在現(xiàn)代城市園林綠化中具有著廣闊的應(yīng)用前景。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR)又稱為微衛(wèi)星DNA,該標(biāo)記技術(shù)具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好、易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種研究[5-9],但在繡球?qū)僦参镅芯恐袘?yīng)用相對(duì)較少。SSR標(biāo)記是一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù),在檢測(cè)過(guò)程中易受PCR反應(yīng)體系中多種因素的影響。目前,國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)關(guān)于繡球?qū)僦参颯SR-PCR反應(yīng)體系的研究報(bào)道,因此建立一套穩(wěn)定、高效的SSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)于開(kāi)展繡球研究很重要。本研究利用正交設(shè)計(jì)對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系中的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶這5個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),篩選出各個(gè)因素的最佳水平,建立適合繡球的SSR-PCR反應(yīng)體系。建立和優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系,為利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展繡球?qū)僦参镞z傳育種研究提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.2生物試劑

SSR-PCR反應(yīng)體系中的10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、DNA Marker、Loading Buffer,購(gòu)自南京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.3基因組DNA提取與檢測(cè)

利用CTAB法提取10個(gè)繡球品種的基因組DNA[10]。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),然后用微量分光光度計(jì)(Nano DropTMSpectrophotometer)測(cè)定DNA的純度和濃度,根據(jù)A260/280比值判斷DNA純度。最后將DNA濃度稀釋至100 ng/μL,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試?yán)C球材料

1.4SSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以大花繡球品種史歐尼的基因組DNA為模板,針對(duì)影響SSR-PCR反應(yīng)的5個(gè)主要因素(Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、DNA模板量、Taq聚合酶量)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。為明確這5個(gè)主要因素在SSR-PCR反應(yīng)體系中的最佳水平,每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平,每個(gè)因素的梯度設(shè)置見(jiàn)表2。采用正交設(shè)計(jì)L25(56)進(jìn)行分析,實(shí)施方案見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)液中除表2中所列之外,還需加入10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.0 μL,剩余用ddH2O進(jìn)行補(bǔ)充,擴(kuò)增體系總體積為20 μL。

1.5PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

總而言之，情緒管理對(duì)于大班幼兒的心理健康成長(zhǎng)有著極其重要的作用。文章先分析了大班幼兒的情緒特點(diǎn)，然后從營(yíng)造良好情緒氛圍、教會(huì)情緒管理方法、加強(qiáng)家園合作力度方面提出了大班幼兒情緒管理能力培養(yǎng)對(duì)策，以供其他幼兒教師參考借鑒。

PCR反應(yīng)在Biometra T-Professional Thermocycler 儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,最佳溫度退火40 s,72 ℃延伸1 min,總共33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL Loading Buffer混勻,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。每個(gè)組合設(shè)有3個(gè)重復(fù),均在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。

表2　繡球SSR-PCR反應(yīng)體系的因素與水平

表3　繡球SSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L25(56)

1.6統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

參照何正文等[11]的方法對(duì)PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì),根據(jù)主帶數(shù)量、非特異性帶數(shù)量、清晰度和彌散程度4個(gè)因素,依次對(duì)每個(gè)處理組合進(jìn)行評(píng)分。主條帶擴(kuò)增數(shù)越多、非特異性條帶數(shù)越少、條帶清晰度越強(qiáng)、彌散程度越小的評(píng)分值越高,反之評(píng)分值就越低;最高記為25分,最低記為1分。將試驗(yàn)結(jié)果輸入SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

1.7最佳SSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

利用優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應(yīng)體系,選取30對(duì)SSR引物對(duì)10個(gè)繡球試材進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),驗(yàn)證該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和通用性。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

利用CTAB法提取10份繡球試材的基因組DNA呈白色絮狀、溶解后為透明狀。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),DNA條帶清晰且無(wú)降解現(xiàn)象,說(shuō)明DNA的完整性好(圖1)。經(jīng)微量分光光度計(jì)檢測(cè),DNA濃度為130～560 ng/μL,A260/280比值為1.8～2.0,說(shuō)明DNA的純度高,可滿足SSR-PCR反應(yīng)要求。

圖1　CTAB法提取繡球基因組DNA的電泳結(jié)果

2.2繡球SSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

2.2.1SSR-PCR反應(yīng)正交設(shè)計(jì)方差分析根據(jù)正交設(shè)計(jì)L25(56)進(jìn)行PCR反應(yīng),采用直觀分析法對(duì)25個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)每個(gè)組合3次重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分,得分依次為:1、6、8、7、6、12、9、7、5、8、19、24、11、12、10、13、15、12、16、11、9、20、17、13、3;1、7、9、6、5、10、8、7、4、8、22、24、13、11、9、12、13、11、15、12、8、18、14、11、2;1、5、8、7、5、11、10、8、4、7、20、25、14、12、11、13、15、13、16、10、9、19、15、12、3。將3次重復(fù)的評(píng)分值取平均數(shù),根據(jù)平均得分結(jié)果進(jìn)行方差分析。

利用SPSS 17.0軟件對(duì)直觀分析的評(píng)分結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明,Mg2+對(duì)反應(yīng)體系的影響最大,而引物對(duì)反應(yīng)體系的影響最小,5個(gè)因素水平的變化對(duì)繡球SSR-PCR反應(yīng)體系的影響從大到小依次為:Mg2+>Taq聚合酶>dNTPs>DNA模板>引物(表4)。不同重復(fù)之間的差異不顯著,證明3個(gè)重復(fù)的評(píng)分結(jié)果有較強(qiáng)的一致性。

表4　繡球SSR-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)方差分析

注:**.在0.01水平上差異顯著。

Note:**.Significant difference at the 0.01 level.

2.2.2DNA模板用量對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響本試驗(yàn)對(duì)DNA模板用量設(shè)置了5個(gè)梯度水平(20,40,60,80,100 ng),結(jié)果表明，結(jié)果均值隨著DNA模板用量的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)(圖2)。當(dāng)DNA模板用量為20 ng時(shí),擴(kuò)增條帶較弱;DNA模板用量增至60～100 ng時(shí),擴(kuò)增條帶亮度增強(qiáng)且數(shù)量相對(duì)增加。從節(jié)省模板用量方面考慮,選擇60 ng作為DNA模板的適宜用量。

圖2　DNA模板濃度與結(jié)果均值的關(guān)系

2.2.3Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響Mg2+是Taq聚合酶的激活劑,濃度過(guò)低會(huì)降低酶活性,而濃度過(guò)高會(huì)擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物。從圖3可以看出,隨著Mg2+濃度的增加結(jié)果均值呈先升高后下降的趨勢(shì),并且各個(gè)濃度之間均達(dá)到差異明顯水平。當(dāng)Mg2+濃度為0.5 mmol/L時(shí),擴(kuò)增條帶很弱;Mg2+濃度增加至1.5 mmol/L,擴(kuò)增條帶清晰且無(wú)非特異性條帶;當(dāng)Mg2+濃度大于1.5 mmol/L,擴(kuò)增條帶亮度無(wú)明顯變化,但出現(xiàn)非特異性條帶。因此,本研究選擇1.5 mmol/L為繡球SSR-PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度的最佳反應(yīng)水平。

圖3　Mg2+濃度與結(jié)果均值的關(guān)系

2.2.4dNTPs濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響dNTPs是SSR-PCR反應(yīng)體系的重要底物,其濃度的大小直接影響PCR擴(kuò)增的效率。結(jié)果表明,結(jié)果均值隨著dNTPs濃度的增加逐漸升高,在0.3 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值,然后隨著dNTPs濃度繼續(xù)增加結(jié)果均值開(kāi)始降低(圖4)。因此,選擇0.3mmol/L為SSR-PCR反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)水平。

圖4　dNTPs濃度與結(jié)果均值的關(guān)系

2.2.5引物濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響引物濃度對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響如圖5所示,結(jié)果均值隨著引物濃度的增加呈升高的趨勢(shì)。引物濃度為0.1～0.5 μmol/L時(shí),均有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。當(dāng)引物濃度為0.1 μmol/L時(shí),由于引物濃度過(guò)低擴(kuò)增條帶較弱;隨著引物濃度的增加,擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量也逐漸增加。考慮到引物濃度過(guò)高,有可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物,確定0.4 μmol/L作為引物的最佳濃度,其擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量最好。

圖5　引物濃度與結(jié)果均值的關(guān)系

2.2.6Taq聚合酶用量對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響Taq聚合酶是SSR-PCR反應(yīng)體系中的重要因素之一。從圖6可以看出,Taq聚合酶用量對(duì)SSR-PCR反應(yīng)體系的影響僅次于Mg2+濃度,結(jié)果均值隨著Taq聚合酶用量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì),在0.8 U時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)Taq聚合酶用量超過(guò)0.8 U時(shí),結(jié)果均值呈逐漸降低的趨勢(shì),擴(kuò)增條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象,且非特異性擴(kuò)增條帶增多(圖6)。從擴(kuò)增效率和節(jié)約經(jīng)濟(jì)方面綜合考慮,確定0.8 U為Taq聚合酶最適用量。

圖6　Taq聚合酶用量與結(jié)果均值的關(guān)系

2.3最佳SSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

綜合上述分析,優(yōu)化后的繡球SSR-PCR反應(yīng)體系如下:20 μL反應(yīng)體系中Mg2+濃度為1.5 mmol/L,dNTPs濃度為0.3 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L,DNA模板量為60 ng,Taq聚合酶量為0.8 U。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,最佳溫度退火40 s,72 ℃ 1 min,33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

以大花繡球品種史歐尼基因組DNA為模板,采用上述正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)30對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選,從中篩選出了擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好的16對(duì)引物。利用這16對(duì)引物對(duì)10個(gè)繡球品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)一步驗(yàn)證上述反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果。其中,引物HM-3、HM-7和HM-12的擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜中可檢測(cè)到清晰明亮且具有多態(tài)性的條帶(圖7)。

圖7　引物HM-3、HM-7和HM-12對(duì)10個(gè)繡球品種擴(kuò)增的結(jié)果

3　討論

近年來(lái),在許多植物中關(guān)于SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究已有很多,但在繡球中還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。建立SSR-PCR反應(yīng)體系是應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)的前提,但是不同植物的最佳反應(yīng)體系會(huì)有所不同,建立適合繡球的SSR-PCR反應(yīng)體系非常重要。目前,PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化主要采用單因素梯度試驗(yàn)法和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。采用單因素梯度試驗(yàn)法優(yōu)化PCR反應(yīng)體系,需要進(jìn)行多次梯度試驗(yàn),這樣不僅時(shí)間消耗長(zhǎng)、試驗(yàn)成本高,而且不能準(zhǔn)確地反映出各因素間的交互關(guān)系[12]。本試驗(yàn)采用的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種快速、經(jīng)濟(jì)、高效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,利用規(guī)格化的正交表將各個(gè)試驗(yàn)因素、水平之間的組合進(jìn)行均勻搭配,選擇具有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn),得到最佳的水平組合,充分考慮了各試驗(yàn)因素的平均分配和交互作用[13]。

PCR反應(yīng)是一個(gè)多因素控制的綜合反應(yīng)體系,容易受到DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶等因素的影響,其中每個(gè)因素都有可能會(huì)影響到擴(kuò)增的效率、特異性及產(chǎn)量[14]。本研究首次利用正交設(shè)計(jì)對(duì)影響繡球PCR反應(yīng)體系的5個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn),建立適合于繡球的SSR-PCR反應(yīng)體系(20 μL):Mg2+濃度為1.5 mmol/L,dNTPs濃度為0.3 mmol/L,引物濃度為0.4 μmol/L,DNA模板量為60 ng,Taq聚合酶量為0.8 U,ddH2O補(bǔ)至20 μL。Mg2+濃度直接影響擴(kuò)增的效率和特異性,適宜的Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)非常重要[15]。本研究發(fā)現(xiàn),Mg2+濃度對(duì)繡球PCR反應(yīng)體系的影響最大,這一結(jié)果與向日葵[15]、梨[16]、紫葉酢漿草[17]等植物的研究結(jié)果相似。在本研究中,Taq聚合酶量對(duì)繡球PCR反應(yīng)體系的影響僅次于Mg2+濃度,當(dāng)用量高時(shí)會(huì)有非特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生,并且增加試驗(yàn)成本。這一結(jié)果與藥用菊花[18]、苦參[19]等植物的研究結(jié)果不同,認(rèn)為Taq聚合酶對(duì)PCR反應(yīng)的影響最大,分析這種差異可能與研究物種和不同因素水平設(shè)計(jì)有關(guān)。dNTPs濃度對(duì)繡球PCR反應(yīng)也會(huì)有一定的影響,濃度低時(shí)會(huì)影響擴(kuò)增的效率,而濃度高時(shí)會(huì)與Taq聚合酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Mg2+進(jìn)而降低酶活性。在本試驗(yàn)中,當(dāng)dNTPs濃度為0.3 mmol/L時(shí)擴(kuò)增結(jié)果最好,這與任鵬鴻等[20]對(duì)菊芋SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的結(jié)果一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)引物濃度對(duì)繡球SSR-PCR反應(yīng)的影響最小,在0.1～0.5 μmol/L的濃度內(nèi)均有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn),但引物濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

本試驗(yàn)利用建立的繡球SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行SSR引物篩選,從30對(duì)引物中篩選出了擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的16對(duì)SSR引物,表明該體系具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。利用這些引物對(duì)10個(gè)繡球品種的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中3對(duì)引物的擴(kuò)增條帶清晰且具有多態(tài)性,進(jìn)一步驗(yàn)證了該反應(yīng)體系具有較好的通用性。因此,本研究建立和優(yōu)化的繡球SSR-PCR反應(yīng)體系,為SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于繡球植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、標(biāo)記輔助育種等研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System inHydrangeamacrophylla

JIA Xinping,SUN Xiaobo,LIANG Lijian,DENG Yanming,SU Jiale,ZHOU Jiantao

(Institute of Horticulture,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Nanjing210014,China)

In order to establish and optimize the SSR-PCR reaction system ofHydrangeamacrophylla,and the orthogonal design L25(56)was applied to optimize the five main factors(Mg2+,dNTPs,primers,DNA template,andTaqenzyme)at five levels of SSR-PCR reaction system.The PCR result was analyzed to select the best levels of five factors and established the suitable SSR reaction system forHydrangeamacrophylla.The results showed that the optimal SSR-PCR system of 20 μL volumes consists of 60 ng DNA template,1.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L primer,and 0.8 UTaqpolymerase.PCR amplification procedures were pre-denaturation for 5 min at 94 ℃;followed by 33 cycles of denaturation for 1 min at 94 ℃,annealing at a suitable for primers for 40 s,extension for 1 min at 72 ℃;and a final extension for 10 min at 72 ℃,then stored at 4 ℃.The optimal SSR-PCR reaction system was used to verify by 10 cultivars ofHydrangeamacrophylla,and the results showed that it was excellent stability and repeatability for the optimal reaction system.The establishment of this reaction system provides a theoretical basis and technical references for further research on the genusHydrangeaby SSR markers.

Hydrangeamacrophylla;SSR-PCR;Orthogonal design;Reaction system

2016-06-13

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2014408)；江蘇省農(nóng)科院成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(KF15(5005))

賈新平(1983-),男,山西晉城人,助理研究員,博士,主要從事觀賞植物分子生物學(xué)研究。

周建濤(1965-),男,江蘇武進(jìn)人,研究員,博士,主要從事園藝及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究。

S68.03

A

1000-7091(2016)04-0068-06

10.7668/hbnxb.2016.04.012