董　婧,逯曉萍 ,呂二鎖,薛春雷，李俊偉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特　010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特　010031)

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玉米蛋白質(zhì)組研究中雙向電泳技術(shù)條件的優(yōu)化

董婧1,逯曉萍1,呂二鎖2,薛春雷1，李俊偉1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010031)

為了優(yōu)化玉米葉片雙向凝膠電泳技術(shù)條件,通過比較3種總蛋白提取方法對(duì)玉米雙向電泳結(jié)果的影響,并對(duì)蛋白質(zhì)上樣量、IEF等電聚焦條件及SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度等參數(shù)進(jìn)行探索、優(yōu)化;結(jié)果發(fā)現(xiàn),與酚提取法和磷酸緩沖液法相比,采用改進(jìn)的TCA/丙酮法提取總蛋白操作簡單、方便,所得的2-DE圖譜中蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量多、背景清晰,是一種適用于提取玉米苗期葉片總蛋白的有效方法;同時(shí)篩選出:第一向IEF等電聚焦樣品上樣量為800 μg,聚焦條件為20 000 V/h,在濃度為12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,能夠在17 cm的IPG膠條上獲得背景低、分辨率較高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜,該優(yōu)化體系適用于玉米葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳分離,對(duì)玉米蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要參考價(jià)值。

玉米;葉片;蛋白質(zhì)提取;雙向電泳

在生命科學(xué)中,對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已成為功能基因組研究的重要手段與內(nèi)容。利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法改良農(nóng)作物的遺傳性狀,指導(dǎo)抗逆及抗病育種等研究都具有重要意義[1-2]。最早由Wilkins在1994年首次提出[3]蛋白質(zhì)組概念,指總體分析細(xì)胞內(nèi)不斷變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平及性質(zhì),進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,是揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能以及細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的一個(gè)研究領(lǐng)域。隨著生命科學(xué)的發(fā)展,蛋白質(zhì)組學(xué)已成為生命科學(xué)研究的重心[4-5];蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容之一,而雙向電泳分離技術(shù)則是最為經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。玉米作為我國重要的糧食和能源作物,對(duì)它的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也正在進(jìn)行中,涉及遺傳、生理生化和生態(tài)等諸多生物學(xué)領(lǐng)域,其中包括組織器官的分化過程、亞細(xì)胞器新蛋白的發(fā)現(xiàn)和功能的鑒定,以及玉米對(duì)干旱、缺氧等非生物脅迫和真菌、細(xì)菌等生物脅迫的適應(yīng)機(jī)制及各種突變體研究領(lǐng)域等[6-8]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)理論與技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新,在玉米遺傳、發(fā)育、育種研究中的應(yīng)用也將會(huì)越來越被重視[9]。

蛋白質(zhì)提取質(zhì)量的好壞是決定雙向電泳試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素。因此,應(yīng)根據(jù)不同作物、不同研究目的選擇適合的蛋白質(zhì)提取方法,以期獲得滿意的雙向電泳圖譜[10]。通常植物組織中含有較多的干擾蛋白質(zhì)提取、分離和鑒定的蛋白水解酶以及多酚、色素、醌類及碳水化合物等干擾物質(zhì),這些物質(zhì)的存在干擾了蛋白質(zhì)雙向電泳分離效果。本試驗(yàn)以合飼一號(hào)玉米品種的苗期葉片為試材,比較分析不同蛋白質(zhì)提取方法對(duì)玉米苗期葉片總蛋白的提取效果,同時(shí)在IEF電泳條件、蛋白質(zhì)上樣量以及 SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度等的選擇上進(jìn)行優(yōu)化,探索適合于玉米苗期葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳技術(shù),為開展玉米蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為玉米合飼一號(hào)[蒙審玉(飼)2012001],選取成熟飽滿的種子種植于實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),幼苗培養(yǎng)至三葉期進(jìn)行總蛋白的提取,或?qū)⒂酌缛~片用液氮速凍,于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存、備用。

1.2幼苗葉片總蛋白的提取方法

1.2.1三氯乙酸/丙酮提取法將供試玉米幼苗培養(yǎng)至三葉期,取三葉期新鮮葉片用蒸餾水清洗、擦干,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用;稱取速凍葉片約 0.3 g,加少量聚乙烯吡咯烷酮約0.03 g,于冷凍條件下研磨至粉末狀;吸取已預(yù)冷的蛋白質(zhì)提取液Ⅰ(含0.07%β-巰基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液) 4.5 mL加入玉米葉片粉末中,再將混合液轉(zhuǎn)入空的 5 mL 離心管中,-20 ℃冰箱中放置1 h左右,期間搖晃2～3次;在 4 ℃條件下,12 000 r/min 離心40 min,棄上清液。加入 4.5 mL預(yù)冷的蛋白質(zhì)提取液Ⅱ(含0.07%β-巰基乙醇丙酮)進(jìn)行懸浮、振蕩,-20 ℃冰箱放置 1 h 以上,離心棄上清液,此步驟重復(fù) 2 次。再加入 4.5 mL 預(yù)冷的 80% 丙酮進(jìn)行懸浮、離心、棄上清液,于通風(fēng)櫥干燥15 min左右。干燥后,稱取蛋白質(zhì)干粉質(zhì)量,進(jìn)行蛋白質(zhì)溶解。

1.2.2酚提取法該方法根據(jù)付忠軍等[11]的植物總蛋白提取方法略作改進(jìn)。稱取2 g新鮮的玉米幼苗葉片,在液氮中快速研磨成精細(xì)粉末,分別加入 0.8 mL苯酚(Tris緩沖液pH值8.0,Sigma) 和0.8 mL SDS 緩沖液(30%蔗糖,2% SDS,65 mmol/L DTT,0.1 mol/L Tris-HCl,pH值8.0),振蕩、混勻后將混合液轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中,于磁力攪拌器上渦旋30 s,之后在4 ℃下12 000 r/min離心5 min,將上層約400 μL的苯酚相轉(zhuǎn)到新的 2 mL離心管中;同時(shí),在苯酚相中加入 5倍體積的含0.1 mol/L 乙酸銨的甲醇溶液,-20 ℃冰箱中放置約50 min;之后在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min,離心結(jié)束后用預(yù)冷的甲醇乙酸銨溶液沖洗2次,最后用80%丙酮懸浮、離心2 次,棄上清液,收集沉淀于通風(fēng)櫥干燥。干燥后,稱取蛋白質(zhì)干粉質(zhì)量,進(jìn)行蛋白質(zhì)溶解。

1.2.3磷酸緩沖液提取法吸取蛋白質(zhì)磷酸緩沖液提取液(1 mol/L KH2PO4+K2HPO4,使用前加1 mol/L L-苯甲基磺酰氟)3.5 mL加入5 mL離心管中,置于冰上預(yù)冷;剪取玉米幼苗三葉期新鮮葉片,用純凈水清洗、濾紙擦干,去主脈剪成約1 cm 小段,稱取2 g葉片,在液氮冷凍條件下迅速研磨成精細(xì)粉末;然后轉(zhuǎn)入離心管中混勻,冰上靜置3～4 h,4 ℃條件下離心,12 000 r/min,45 min。將上清液轉(zhuǎn)到新的離心管再離心1次,取上清即蛋白提取液,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3蛋白質(zhì)的溶解

采用稱量法計(jì)算蛋白干粉質(zhì)量,每mg蛋白質(zhì)干粉加 20～30 μL裂解液,成分為(5% β-巰基乙醇、9.0 mol/L 尿素、4%兩性電解質(zhì)、0.2% pH值 3～10 兩性電解質(zhì)載體),充分混合,懸浮、振蕩2 min,35 ℃保溫 30 min,12 000 r/min離心 40 min,取上清液即為蛋白提取液,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4IEF等電聚焦電泳條件的優(yōu)化

在第一向IEF等電聚焦時(shí)選用 IPG 固相膠條(pH值4～7,長17 cm)及 IPG phorⅡ系統(tǒng),取蛋白樣品加裂解液至總體積為450 μL,緩慢均勻加入到IPG膠條槽內(nèi),使IPG固相膠條膠面朝下覆于樣品上,最后加2～3 mL礦物油于膠面上,操作完成后將聚焦槽放置于Ettan DALT six型電泳儀內(nèi),每根膠條以50 μA的極限電流和18～20 ℃聚焦溫度,設(shè)計(jì)了4個(gè)IEF等電聚焦條件進(jìn)行優(yōu)化。

IEF等電聚焦運(yùn)行程序Ⅰ設(shè)置為:18 ℃,50 V主動(dòng)水化16 h,250 V線性除鹽 30 min,500 V快速除鹽30 min,4 000 V線性升壓3 h,20 000 V/h 快速聚焦和500 V 72 h保持;程序Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的聚焦參數(shù)分別為14 000,17 000,23 000 V/h聚焦,其余條件相同 (表1)。

表1　IEF等電聚焦參數(shù)

等電聚焦結(jié)束后,將膠條依次放入平衡液Ⅰ(6 mol/L Urea,20.0%甘油,2.0%DTT,2.0%SDS,0.375 mol/L This-HCl pH值8.8)和平衡液Ⅱ(6 mol/L Urea,20.0%甘油,2.5 %碘乙酰胺,2.0%SDS,0.375 mol/L This-HCl pH值8.8)各平衡15 min,最后轉(zhuǎn)到12.5% SDS-PAGE凝膠(厚度1 mm)中進(jìn)行電泳。

1.5SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度的優(yōu)化及考馬斯亮藍(lán)G-250的凝膠染色

設(shè)計(jì)10.0%,12.5%,15.0% 3個(gè)不同凝膠濃度進(jìn)行總蛋白的第二向電泳優(yōu)化篩選。首先將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,一端加SDS標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),再用1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠封閉,放入凝膠電泳系統(tǒng)進(jìn)行電泳,設(shè)置18 ℃循環(huán)水冷卻降溫,80 V的電壓預(yù)電泳20 min,之后換用120 V的電壓電泳,當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距膠底邊緣 1.5 cm 左右停止電泳。

采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行凝膠染色。當(dāng)電泳結(jié)束后,將膠板置于固定液(40% (V/V)甲醇,10% (V/V)冰乙酸)中固定30 min;固定結(jié)束后用超純水漂洗15 min,重復(fù)2次;之后膠體于考馬斯亮藍(lán)染色液(0.20% (m/V) G-250考馬斯亮藍(lán),40% (V/V)無水乙醇,10% (V/V)冰乙酸)中緩慢搖動(dòng)染色4～6 h。染色接受后,將膠板轉(zhuǎn)移至脫色液中脫色,待膠板背景無色為止。

1.6電泳圖像掃描與分析

使用掃描儀UMAX Powerlook 2100XL將待檢測的凝膠進(jìn)行成像系統(tǒng)掃描獲取圖像,光學(xué)分辨率為600 dpi的透射掃描,對(duì)比度與亮度均采用軟件默認(rèn)值。掃描后圖像用PDQuest 8.0分析軟件進(jìn)行斑點(diǎn)檢測、匹配和獲取斑點(diǎn)位置等。

2　結(jié)果與分析

2.1不同提取方法對(duì)雙向電泳圖譜效果的影響

樣品的制備是進(jìn)行雙向電泳的先決條件,通常植物總蛋白的制備分為:樣品提取、裂解液配方選擇和雜質(zhì)去除等幾個(gè)關(guān)鍵步驟。本試驗(yàn)采用酚提取法、三氯乙酸/丙酮法以及磷酸緩沖液提取法制備玉米葉片總蛋白樣品。采用相同的參數(shù)與方法對(duì)3種不同方法提取的玉米葉片總蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳的分離和檢測,具體參數(shù)為:蛋白質(zhì)上樣量800 μg,長17 cm、pH 值4～7 IPG干膠條,12.5% SDS-PAGE 進(jìn)行雙向電泳分離;電泳后膠體經(jīng)考染的圖像結(jié)果(圖1)顯示,采用三氯乙酸/丙酮法(TCA)所獲得的2-D圖譜中蛋白點(diǎn)分布均一,蛋白點(diǎn)呈規(guī)則、清晰的圓形,圖譜背景干凈,橫豎條紋干擾較少(圖1-A)。選用酚提取法制備的蛋白質(zhì)所得的2-D圖譜(圖1-B) 分辨率低,蛋白點(diǎn)較模糊,圖片中顯示有蛋白點(diǎn)拖尾現(xiàn)象,出現(xiàn)橫豎紋干擾,可能是由于樣品中含有較高濃度的鹽離子等雜質(zhì),等電聚焦時(shí)電流比較大受到干擾。而選用磷酸緩沖液提取法制備玉米葉片總蛋白樣品得到的 2-D圖譜效果有明顯改善(圖1-C),但在圖譜中檢測到的蛋白點(diǎn)較少,蛋白質(zhì)種類少,純度不高。所以三氯乙酸/丙酮法(TCA) 電泳結(jié)果質(zhì)量最佳,提取玉米總蛋白質(zhì)量較好,適于玉米蛋白質(zhì)組學(xué)的2-D試驗(yàn)。

A.三氯乙酸/丙酮法;B.酚提取法;C.磷酸緩沖液(PB)提取法。

2.2不同聚焦條件對(duì)雙向電泳圖譜效果的影響

IEF等電聚焦電泳是進(jìn)行雙向電泳技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù),聚焦能否達(dá)到平衡、是否反應(yīng)完全都會(huì)影響蛋白點(diǎn)的分離效果[12]。在總蛋白樣品的提取過程中,通過增加冷丙酮洗滌次數(shù)可有效去除玉米蛋白樣品中的鹽離子;同時(shí),在等電聚集電泳中增加低電壓除鹽過程,使等電聚焦能達(dá)到預(yù)設(shè)的聚焦平衡電壓20 000 V/h,第一向IEF等電聚焦在其他條件不變的情況下電壓設(shè)置決定聚焦的效果好壞。將蛋白樣品制備方法、上樣量、平衡時(shí)間、SDS-PAGE凝膠濃度以及染色方法都保持一致情況下,分析比較4種不同等電聚焦條件(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)下的雙向電泳效果。圖2所示,當(dāng)選擇等電聚焦條件為20 000 V/h時(shí),所獲得的雙向電泳圖譜上蛋白點(diǎn)數(shù)量多、清晰,且蛋白點(diǎn)多為圓形,減少了蛋白質(zhì)點(diǎn)的水平和垂直拖尾現(xiàn)象,聚焦效果也最好;聚焦時(shí)間的減少或延長,都會(huì)引起凝膠圖片出現(xiàn)條紋或橫向拖尾現(xiàn)象。

圖2　不同聚焦條件雙向電泳對(duì)比

2.3丙烯酰胺濃度對(duì)蛋白點(diǎn)分辨率的影響

在進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí),其分離膠濃度的大小會(huì)直接影響蛋白質(zhì)分離效果的好壞,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)10.0%，12.5%，15.0% 3個(gè)不同濃度的分離膠進(jìn)行玉米幼苗葉片蛋白質(zhì)的分離(圖3)。當(dāng)丙烯酰胺濃度選用12.5%,制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠時(shí),供試樣品中能夠分離出多個(gè)清晰、明亮的條帶,且無拖尾和彌散現(xiàn)象,各個(gè)條帶之間的遷移率相差明顯;當(dāng)丙烯酰胺濃度為10.0%和15.0%制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠時(shí),其圖譜上分離出的條帶較少、模糊,不夠清晰,且遷移率相差較小不明顯,不能對(duì)供試樣品進(jìn)行有效分離;此外,當(dāng)凝膠濃度較大時(shí),其凝膠膠體較脆,在第二向電泳制備大面積凝膠時(shí)容易破碎,不利于操作;其次,凝膠濃度太大,電泳時(shí)蛋白質(zhì)的前沿離溴酚藍(lán)指示劑前沿會(huì)產(chǎn)生較大的距離,整個(gè)電泳過程緩慢。因此,第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠的最適濃度應(yīng)為12.5%,該濃度下玉米幼苗葉片總蛋白可得到有效分離。

圖3　不同濃度SDS-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)玉米幼苗葉片總蛋白分離效果的影響

2.4等電聚焦過程中不同上樣量對(duì)蛋白質(zhì)分辨率的影響

以傳統(tǒng)的三氯乙酸/丙酮法(TCA)提取玉米幼苗葉片總蛋白,采用長17 cm、pH值4～7 IPG線性膠條,將蛋白樣品上樣量設(shè)計(jì)為500，800，1 000 μg 3個(gè)不同的梯度進(jìn)行雙向電泳的結(jié)果分析(圖4),由PDQuest8.0軟件分析可知,蛋白上樣量為500 μg時(shí),雙向電泳圖譜上的蛋白點(diǎn)數(shù)量明顯較少,蛋白質(zhì)點(diǎn)拖尾現(xiàn)象明顯,低豐度蛋白不容易被檢測從而造成丟失,影響雙向電泳試驗(yàn)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性(圖4-A);當(dāng)?shù)鞍咨蠘恿繛?00 μg時(shí)(約650個(gè)),蛋白點(diǎn)最多,同時(shí)蛋白點(diǎn)較清晰,無拖尾與條紋現(xiàn)象,且蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻,聚焦效果好,圖譜質(zhì)量佳(圖4-B);在蛋白上樣量為1 000 μg時(shí),蛋白點(diǎn)較多,高豐度蛋白點(diǎn)過大,出現(xiàn)飽和重疊現(xiàn)象,掩蓋了其余蛋白斑點(diǎn),凝膠圖譜上橫豎條紋和拖尾現(xiàn)象明顯,影響蛋白點(diǎn)的分離與分析(圖4-C)。

上樣量分別為A.500 μg;B.800 μg;C.1 000 μg。

3　討論

3.1玉米葉片總蛋白的提取方法

隨著新科技的不斷向前發(fā)展,2-D分離技術(shù)已從載體兩性電解質(zhì)管膠發(fā)展到固相pH梯度IPG雙向凝膠電泳,顯著提高了2-D分離技術(shù)分離植物總蛋白的重復(fù)性與分辨率[13]。不同的植物組織中,總蛋白的提取以及雙向電泳條件等一些環(huán)節(jié)需進(jìn)行不斷的完善、優(yōu)化。

近些年,在植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,通過雙向電泳分離、鑒定總蛋白取得了顯著成果,該技術(shù)也成為目前所應(yīng)用的電泳技術(shù)中信息含量最大、分辨率最高的分離技術(shù)[14-15];因而在進(jìn)行植物總蛋白樣品制備時(shí),盡可能保留較多的蛋白質(zhì)種類,且不易降解?？偟鞍椎奶崛∵^程,包括組織破碎、溶解、變性和還原等幾個(gè)主要步驟,可破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用,除去如核酸、色素等非蛋白物質(zhì)[16]。本研究以酚提取法、三氯乙酸/丙酮法(TCA)及磷酸緩沖液提取法提取玉米總蛋白,對(duì)3種方法所提取的樣品進(jìn)行Bradford 法蛋白定量分析;隨后在上樣量800 μg,分離膠17 cm、pH值4～7 IPG膠條,12.5%的SDS-PAGE進(jìn)行2-D分離。電泳后圖譜表明,三氯乙酸/丙酮提取法(TCA)所得到的2-D凝膠圖譜蛋白點(diǎn)最多,蛋白點(diǎn)呈圓形,凝膠背景干凈,橫豎條紋干擾少,電泳圖譜質(zhì)量佳。樣品整個(gè)提取過程需在 4 ℃以下進(jìn)行,可有效地防止總蛋白的降解。在冷丙酮和三氯乙酸沉淀總蛋白時(shí),于提取過程中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP),明顯地減少玉米葉片中色素、酚等非蛋白物質(zhì)對(duì)玉米葉片總蛋白純度的影響。增加80%冷丙酮洗滌和沉淀過程,同時(shí)在離心時(shí)加大轉(zhuǎn)速和延長離心時(shí)間,能夠有效地除去總蛋白樣品中的鹽分,減少雙向電泳中條紋干擾的現(xiàn)象。

3.2不同聚焦條件對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

在進(jìn)行雙向電泳過程中等電聚焦與SDS-PAGE是否合理、完全,都會(huì)影響到蛋白點(diǎn)在凝膠橫向和縱向上的分離效果[17-18]。采用雙向凝膠電泳分離植物組織總蛋白中每一步都很關(guān)鍵,但等電聚焦的好壞顯得尤為重要,聚焦能否達(dá)到平衡直接影響總蛋白的分離效果[19]。所以,雙向電泳后圖譜上的蛋白點(diǎn)形狀規(guī)則、分辨率高、蛋白點(diǎn)數(shù)量多表明雙向電泳的分離效果好。在等電聚焦過程時(shí),溫度不應(yīng)超過20 ℃,聚焦過程中裂解液中含有高濃度的尿素,在溫度高于37 ℃尿素分解會(huì)產(chǎn)生氰酸鹽,可能引起蛋白質(zhì)的氨基甲酰化作用,影響蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)[20];當(dāng)聚焦總時(shí)間在30 h 左右,不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)能夠較好地得到分離。聚焦結(jié)束后,膠條最好直接進(jìn)行平衡,或在水化盤中于-70 ℃暫存,但不應(yīng)超過72 h,以防蛋白質(zhì)降解。2次平衡的時(shí)間都不宜超過15 min,但不少于10 min,時(shí)間過長會(huì)引起蛋白質(zhì)發(fā)生降解,過短則蛋白質(zhì)還原不完全,不利于第二向電泳的分離。通過設(shè)計(jì)4種不同的等電聚焦 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ) 條件對(duì)玉米葉片總蛋白雙向電泳條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:聚焦條件為20 000 V/h時(shí),電泳后凝膠圖譜上蛋白點(diǎn)較多且清晰,水平及垂直條紋少,聚焦效果最好。

3.3上樣量與丙烯酰胺濃度對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響

植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的不同,應(yīng)對(duì)分離膠的濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。當(dāng)要分離的蛋白質(zhì)分子量較大時(shí),應(yīng)在進(jìn)行研究該類蛋白質(zhì)過程中適當(dāng)減小分離膠的濃度,從而更好地分離這類蛋白質(zhì)[21]。通過對(duì)玉米幼苗葉片總蛋白在10.0%，12.5% 和15.0% 3個(gè)丙烯酰胺濃度下蛋白質(zhì)的分離效果鑒定;結(jié)果顯示,分離玉米葉片總蛋白的分離膠濃度應(yīng)為12.5%,該濃度對(duì)玉米葉片總蛋白的分離效果最佳,條帶清晰、無拖尾、條紋等現(xiàn)象發(fā)生。

選擇合適的上樣量是獲得高質(zhì)量雙向電泳圖譜的關(guān)鍵,而過低上樣量不利于低豐度蛋白點(diǎn)的檢測,過高則得到的蛋白點(diǎn)甚至比過低上樣量時(shí)的蛋白點(diǎn)更少,因?yàn)榈入娋劢箷r(shí)蛋白質(zhì)濃度過高會(huì)在膠槽中沉淀,不能很好地進(jìn)入IPG膠條中[22];并且蛋白上樣量增加,有利于低豐度蛋白質(zhì)顯現(xiàn),而在蛋白上樣量過高時(shí),高豐度蛋白斑點(diǎn)過大,影響其他蛋白點(diǎn)的分離與分析。而且,蛋白樣品溶液過多則不能被膠條充分吸收,會(huì)使電泳不能正常進(jìn)行[23]。因此,選擇合適的蛋白上樣量,應(yīng)根據(jù)不同的目的、方法及IPG膠條長度和pH范圍確定,并且蛋白上樣量的確定也應(yīng)考慮蛋白質(zhì)染色方法。通過采用17 cm的IPG膠條,樣品蛋白上樣量800 μg所獲得的雙向電泳圖譜蛋白點(diǎn)最多,且蛋白點(diǎn)清晰,無橫、豎條紋干擾,圖譜質(zhì)量最好。

[1]阮松林,馬華升,王世恒,等.植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展Ⅱ.蛋白質(zhì)組技術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].遺傳,2006,28(12):1633-1648.

[2]Gottlieb L D,De Vienne D.Assessment of pleiotropic effects of a gene substitution in pea by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis[J].Genetics,1988,119(3):705-710.

[3]Wilkins M R,Sanchez J C,Gooley A A,et al.Progress with proteome projects:why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J].Biotechnology & Genetic Engineering Reviews,1996,13(13):19-50.

[4]Kahn P.From genome to proteome:looking at a cell′s proteins[J].Science,1995,270(5235):369-370.

[5]Swinbanks D.Government backs proteome proposal[J].Nature,1995,378(6558):653.

[6]石丹,孫向東,張?bào)?玉米胚芽蛋白提取利用研究進(jìn)展及開發(fā)前景[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(7):162-167.

[7]康美玲,田忠景,張倩倩.利用醇溶蛋白電泳圖譜分析不同玉米品種的遺傳多樣性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(10):70-72.

[8]Iccardi F,Gazeau P,Jacquemot M P,et al.Deciphering genetic variations of proteome responses to water deficit in maize leaves[J].Plant Physiol Biochem,2004,42(12):1003-1011.

[9]王偉,楊文鵬.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在玉米遺傳研究中的應(yīng)用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(8):11-14.

[10]李紅兵,康振生.適于小麥葉片蛋白質(zhì)組分析的樣品提取方法研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2011,31(3):632-638.

[11]付忠軍,丁冬,進(jìn)茜寧,等.玉米花絲蛋白質(zhì)組雙向電泳條件的優(yōu)化[J].植物生理學(xué)通訊,2009,45(12):1215-1220.

[12]高冬麗,高金鋒,黨根友,等.蕎麥籽粒蛋白質(zhì)組分特性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(2):68-71.

[13]Wan J H,He F C.Progress in proteomics technology[J].Chinese Science Bulletin,1999,44(9):904-910.

[14]王猛,李云鋒,王振中.適用于甜菜玉米葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,33(3):421-423.

[15]張燕,何文錦,葉冰瑩,等.甘蔗葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)優(yōu)化[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,27(1):80-84.

[16]萬獻(xiàn)平,王淑珍,趙蕓,等.植物應(yīng)答生物逆境的蛋白組學(xué)研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2014,12(3):584-602.

[17]王振華,王志方,陳水森,等.甘藍(lán)型油菜根系可溶性蛋白的提取及雙向電泳體系的優(yōu)化[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(2):219-224.

[18]尹穩(wěn),伏旭,李平.蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2014(1):32-38.

[19]丁承強(qiáng),馬丹,王紹華,等.水稻蛋白質(zhì)組雙向電泳優(yōu)化流程及方法[J].植物學(xué)報(bào),2011,46(1):67-73.

[20]李達(dá),李強(qiáng),關(guān)西貞,等.白粉菌侵染Pm21近等基因系的早期蛋白組差異研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2012,27(1):5-11.

[21]宋慧,張香琴,應(yīng)泉盛,等.瓜類異屬間嫁接親和/不親和組合形成過程中特異蛋白的產(chǎn)生[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2013,28(2):20-26.

[22]陳蕊紅,張改生,劉衛(wèi),等.小麥花藥蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2008,22(4):404-409.

[23]潘怡歐,劉琳琳,張炬紅,等.席景會(huì)茉莉酸誘導(dǎo)的擬南芥葉片蛋白質(zhì)組分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,25(2):35-39.

Two Dimensional Electrophoresis of Optimization and Extraction of Proteome Research of Maize

DONG Jing1,LU Xiaoping1,Lü Ersuo2,XUE Chunlei1,LI Junwei1

(1.College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot010019,China;2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Huhhot010031,China)

In order to establish a set of two dimensional gel electrophoresis technique for maize,the effects of three kinds of total protein extraction methods on the results of two dimensional electrophoresis of maize were studied.Meanwhile,the protein sample volume,condition of isoelectric focusing and the density of polyacrylamide gel were explored and optimized.The results showed that TCA-acetone for total protein extraction was simple and convenient compared with the method of phenol extraction and phosphate Buffer (PB) solution method.The 2-D maps had abundant protein spots and more clear background,this study established a suitable proteomics methods for forage maize.Meantime,it screened out the first dimension electrophoresis was performed on the sample 800 μg and focus conditions 20 000 V/h;The second electrophoresis was performed on 12.5% polyacrylamide gels,it could be obtained two-dimensional electrophoresis map at 17 cm of background low and higher resolution.Optimization system would be suitable for two dimensional electrophoresis of total protein of forage maize leaves,the method can be applied to corn leaf proteome analysis of sample extraction.The useful information can be provided for the proteomics research of maize.

Maize;Leaf;Protein extraction;Two-dimensional electrophoresis (2-D)

2016-04-11

內(nèi)蒙古自治區(qū)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(20131410);內(nèi)蒙古呼和浩特科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(2013-重-計(jì)-1)

董婧(1989-),女,內(nèi)蒙古呼和浩特人,在讀博士,主要從事植物遺傳育種研究。

逯曉萍(1960-),女,內(nèi)蒙古呼和浩特人,教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事植物遺傳育種研究。

S513.03

A

1000-7091(2016)04-0013-06

10.7668/hbnxb.2016.04.003