季曉芬，汪登強，段辛斌，劉紹平，陳大慶

(1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢　430070；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢　430223)

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快速鑒定四大家魚早期資源種類的PCR方法

季曉芬1,2，汪登強2，段辛斌2，劉紹平2，陳大慶2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢430070；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

根據(jù)線粒體控制區(qū)序列設計了青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)物種特異的PCR引物，通過對四大家魚受精卵的PCR擴增，種間交叉擴增，相關(guān)種類早期資源的擴增以及未知種類魚卵的鑒定發(fā)現(xiàn)，所設計的引物具有很高的種類特異性，對特定種DNA具有良好的擴增效果，但是不能進行交叉擴增，對四大家魚外的其它種類也不能擴增。實驗沒有出現(xiàn)一例假陽性或假陰性結(jié)果，說明所設計引物的種類特異性高。該方法特別適合從魚類早期資源大量樣本中準確快速鑒定四大家魚種類。

四大家魚；種類特異引物；PCR；分子鑒定

青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙 (Aristichthysnobilis)是中國傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”，具有重要的經(jīng)濟地位。然而，近三十年來，由于過度捕撈、水體污染、涉水工程建設等原因，四大家魚自然資源量呈明顯下降趨勢。在2010—2011年漁業(yè)資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長江中游四大家魚在漁獲物中已不占優(yōu)勢[1]。對早期資源監(jiān)測也發(fā)現(xiàn)，長江中游四大家魚早期資源量也顯著下降[2]。早期資源監(jiān)測，特別是四大家魚早期資源監(jiān)測是當前開展?jié)O業(yè)資源管理的基礎性工作，并為各種保護措施的效果評估提供科學依據(jù)，具有重要的意義。

在魚類繁殖季節(jié)，江河中有多種魚類同時進行繁衍生息，要正確評估四大家魚早期資源的變化，需要從魚類早期資源中準確判斷四大家魚種類。以往對四大家魚早期資源的鑒定主要依靠魚卵卵徑和顏色，或者魚苗體型和花紋(易伯魯?shù)龋?988)[3]，但是，顏色和花紋并非一成不變，種類間也存在重疊特征，要準確確定不僅需要一定的實踐經(jīng)驗，同時也不容易區(qū)分。近年來也發(fā)展了一些分子生物學鑒定方法，如隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)[4]、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性DNA(RFLP)[5]、DNA條形碼[6]、微衛(wèi)星標記[7]以及PCR[8]等。這些方法提供準確的種類鑒定技術(shù)，但要從大量早期資源樣本開展鑒定，十分費事費力，費用也很大。本研究在分析群體數(shù)據(jù)的基礎上，根據(jù)四大家魚線粒體DNA控制區(qū)的特異性，分別設計一對物種特異的引物，利用PCR技術(shù)特異擴增出四大家魚的DNA片段，從而能夠快速準確鑒定出四大家魚種類，為四大家魚早期資源監(jiān)測及種類鑒定提供一種便捷方法。

1　材料與方法

1.1引物設計

根據(jù)PCR的原理，我們比較了四大家魚之間及其與其他相關(guān)魚類線粒體DNA控制區(qū)序列，遵循種類序列保守、種間差異大的原則，分別設計四大家魚種類特異的引物如下(見表1)。這些引物除了鰱和鳙共用一條反向引物HymDR、位于線粒體DNA tRNA-Phe基因外，其余引物均位于控制區(qū)。引物在線粒體DNA的位置參考青魚線粒體DNA(GenBank登錄號：EU979305)。

此外，魚類線粒體DNA cytb基因通用引物[9]用于擴增魚卵DNA及測序，進行種類鑒定。

表1　四大家魚PCR特異引物信息Tab.1　PCR Specific primers of the four carps

1.2實驗設計及樣本采集

為了驗證方法的可靠性，本研究通過下列4個實驗進行：(1)引物在四大家魚種內(nèi)擴增效率。將4對引物分別擴增相應的魚的樣本。每種樣本收集30粒受精卵，采集4種魚類受精卵各30粒，在2013年5月份四大家魚繁殖季節(jié)采集于長江水產(chǎn)研究所荊州市窯灣繁殖場人工繁殖魚卵，受精后24 h取樣。(2)引物在四大家魚種間交叉擴增特異性。將上述4對種特異引物分別擴增其它3種四大家魚的受精卵樣本，樣本來源與前面相同。(3)引物對長江常見魚類的早期資源擴增特異性。共采用27種魚類(表2)，所有樣本均為受精卵或魚苗，2013—2015年5—7月份取自長江湖北監(jiān)利江段和重慶江段。所有樣本均預先用cytb基因通用引物L14724 和H15915擴增并測序，在GenBank數(shù)據(jù)庫比對，以99%以上序列相似性為準，確定其種類，每一種各取5個。(4)對未知種類受精卵的種類的鑒定。2014年5—7月份本課題組在長江湖北省宜都江段開展早期資源監(jiān)測，從收集的受精魚卵隨機挑選30粒。以上樣本均在現(xiàn)場作好記錄后，用無水乙醇保存，帶回實驗室備用。所有的PCR均設陽性對照，即采用引物特異的種類作模板。

1.3基因組DNA提取及 PCR擴增

基因組DNA采用試劑盒Easy-DNA kit(Omega公司，美國)提取。PCR擴增體系為25 μL，含10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL、Taq DNA聚合酶1.5 U、10 mol/L dNTP 0.5 μL、引物10 pmol/L各1 μL、DNA模板1 μL。擴增條件為94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。cytb基因擴增體系前面相同，擴增條件采用56 ℃退火溫度。

表2　四大家魚及相關(guān)魚類Tab.2　Four major Chinese carps and related fishes

1.4電泳檢測

采用1×TAE緩沖液(0.04 mol/L Tris-乙酸，2 mmol/L EDTA,pH8.5)配制1%瓊脂糖凝膠，凝膠中加入終濃度約為0.5 μg/mL的溴化乙錠(EB)。取3μL PCR產(chǎn)物與1μL Loading Buffer混合，加入點樣孔， 10 v/cm電泳20 min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，照相。

1.5DNA測序與種類鑒定

魚卵cytb基因PCR擴增后，瓊脂糖凝膠純化回收目的片段，采用與PCR相同的引物進行雙向測序。與GenBank數(shù)據(jù)上參考序列(序列號見表2)相似度在99%以上的，即確定為該種類。

2　結(jié)果

2.1引物在四大家魚受精卵中擴增效果

本研究設計的4組種類特異的PCR引物分別擴增相應的四大家魚受精卵結(jié)果見圖1。從圖1可見，4組引物分別對四大家魚30粒受精卵均能擴增出單一、明顯的DNA片段，其中草魚擴增片段大小約為900 bp，青魚約為750 bp，鰱約為950 bp，鳙約為600 bp，與引物設計長度一致。這表明，本研究所設計的引物針對四大家魚具有良好的PCR擴增效果。

4組種特異引物對四大家魚其它3種魚受精卵

圖1　四大家魚PCR擴增結(jié)果Fig.1　Results of PCR amplication of four major Chinese carps

a.草魚，b.青魚，c.鰱，d.鳙，e.青(1-5)、草(6-10)、鰱(11-15)、鳙(16-20)，DNA分子量標準大小從上往下依次為2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp

的PCR結(jié)果顯示，青魚特異引物均不能擴增出草魚、鰱、鳙的DNA(圖2)，其它引物的擴增結(jié)果也類似。說明，這4組種特異引物不能進行交叉擴增，具有較高的種特異性。圖2示青魚特異引物對其它3種四大家魚的PCR擴增結(jié)果。

2.2引物對長江常見27種魚的PCR結(jié)果

4組引物對長江常見的27種魚受精卵或魚苗的PCR擴增結(jié)果見圖3。從圖3中可見，4組引物除了在特定魚中能擴增出特異DNA帶，而在其它魚類中沒有明顯的擴增條帶。例如，引物(I)在青魚中能擴增出一條約750 bp的目的DNA帶外，其它26種魚中均沒有DNA條帶(圖3a)。引物(II～IV)的擴增結(jié)果也相似。

圖2　引物組I擴增四大家魚結(jié)果Fig.2　Amplification result of the four carps using primer I 從左到右為青(1-5)、草(6-10)、鰱(11-15)、鳙(16-19)

圖3　4種引物與27種魚的PCR結(jié)果Fig.3　PCR results of four primers for 27 kinds of fishes

a為引物I，b為引物II，c為引物III，d為引物IV，圖中M為DNA分子量標準。

2.3對未知種類魚卵的鑒定

圖4　未知種類魚卵的PCR結(jié)果Fig.4　PCR results of unknown species of fish eggs a為引物組II，b為引物組III

3　討論

本研究根據(jù)線粒體DNA控制區(qū)序列的種類差異性，設計了4對四大家魚種類特異的引物，通過對較大樣本的特定種類PCR擴增以及種間交叉擴增，結(jié)果顯示，這些引物對特定種具有良好的擴增效果，對交叉種類則完全沒有擴增，實驗沒有出現(xiàn)一例假陽性或假陰性結(jié)果，說明所設計引物的種類特異性高。由于四大家魚以及相近種類在系統(tǒng)進化中地位很近，即使是變異率較大的線粒體DNA控制區(qū)序列在這些種類間相似性也很高，我們在設計引物時，為了提高種類特異性，選擇了差異較大的區(qū)域，并保證引物組中一條或兩條引物的3′與特定種完全一致，與其它種盡可能有差異，同時通過提高PCR退火溫度來降低引物錯配率。從實驗結(jié)果看，達到預期的目的。

實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，PCR技術(shù)是一項十分靈敏的技術(shù)，對早期資源鑒定，一定要避免DNA樣本交叉污染，否則容易出現(xiàn)假陽性。在野外工作中，收集的早期資源量比較大，各種類卵苗經(jīng)常同時出現(xiàn)，保存時也常保存在一個樣本瓶中。因此，在提取DNA時一定要將樣本外表清洗干凈，由于樣本小，可以將樣本分開后用蒸餾水浸泡過夜，期間換水幾次，減少樣本表面附著的外源DNA。本研究中也發(fā)現(xiàn)疑似外源DNA污染的情況，如圖3d，25號樣本，盡管經(jīng)DNA測序確定漢水薄鰍，但電泳中出現(xiàn)很弱的、與鳙目的DNA大小相同的條帶。這也可能是樣本序列變異造成的，但是DNA條帶亮度差異很大，總體上并不影響結(jié)果的判定。

本研究建立的方法很適合應用于從早期資源監(jiān)測收集的大量樣本中快速鑒定出四大家魚種類，也可用于外部形態(tài)不完整的組織塊等鑒定。由于長江等河流還有很多種魚類，今后還需采集更多種類的魚進一步驗證引物的特異性。此外，這4組引物擴增得片段大小有差異，所以通過優(yōu)化PCR條件，開展多重PCR，可以更快更好的完成種類鑒定。

[1]范振華,巴家文,段辛斌.長江宜昌至城陵磯江段魚類資源現(xiàn)狀及物種多樣性研究[J].淡水漁業(yè),2012,42(4):20-25．

[2]Duan X B,Liu S P,Huang M G,et al.Changes in abundance of larvae of the four domestic Chinese carps in the middle reach of the Yangtze River,China,before and after closing of the Three Gorges Dam[J].Environ Biol Fish,2009,86:13-22．

[3]易伯魯,余志堂,梁秩燊,等.葛洲壩水利樞紐與長江四大家魚[M].武漢：湖北科學技術(shù)出版社,1988．

[4]鄧懷,張四明,汪登強,等.十種常見淡水魚類的RAPD鑒定[J].淡水漁業(yè),1998,28(1):8-10．

[5]楊玲,郝大奎,付佩勝.利用線粒體DNA Cytb基因PCR-RFLP分析方法鑒別青魚和草魚[J].山東師范大學學報：自然科學版,2014，(1):141-146．

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[9]Xiao W,Zhang Y,Liu H.Molecular systematics of Xenocyprinae (TeleosteiCyprinidae):taxonomy,biogeography,and co-evolution of a Special group restricted in East Asia[J].Mole Phylogenet Evol,2001,18:163-173．

(責任編輯：張瀟峮)

Species identification of early life of four major Chinese carps by PCR method

JI Xiao-fen1,2,WANG Deng-qiang2,DUAN Xin-bin2,LIU Shao-ping2,CHEN Da-qing2

(1.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China)

In China,Mylopharyngodonpiceus,Ctenopharyngodonidellus,HypophthalmichthysmolitrixandAristichthysnobilisare regarded as “four major Chinese carps”.In order to identify species of these carps quickly from large numbers of early life resource of river,we designed four species-specific PCR primers for the carps based on sequences of mitochondrial DNA control region.Validity of the primers was tested through samples in four major Chinese carps themselves,across them and some other common fish species from Yangtze River using PCR technology.The results of PCR showed that the aimed DNA bands were appeared clearly in primer-specific carps respectively but not amplified across four major Chinese carps,or in other common fish species.We also have taken positive and negative control in all PCR experiment,and no false results were found,which indicate that the designed species-primers worked effectively for four major Chinese carps.These primer sets is particularly suitable for rapidly identifying four major Chinese carp species from early life resources of ambiguous morphological characteristics.

four major Chinese carps;species-specific primer;PCR;molecular identification

2016-02-29；

2016-05-17

國家自然科學基金(51579247)

季曉芬(1991-)，女，碩士研究生，專業(yè)方向為漁業(yè)資源(種質(zhì)資源保護)。E-mail:13339984376@126.com

陳大慶。E-mail:chdq@yfi.ac.cn

S917

A

1000-6907-(2016)05-0003-05