馬全英，杜 平，祝秀梅，劉 萍，宋玉霞，董金杰，王超英，張?jiān)频?/p>

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

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利用離子交換層析方法分離與純化口蹄疫病毒抗原

馬全英，杜 平，祝秀梅，劉 萍，宋玉霞，董金杰，王超英，張?jiān)频?/p>

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

[目的]利用離子交換層析方法分離與純化口蹄疫病毒抗原。[方法]利用陰離子交換樹(shù)脂制備高純度的FMDV抗原，通過(guò)對(duì)樣品及緩沖液pH、流速、緩沖液的鹽濃度、樣品上樣體積等條件的摸索，確定最佳的FMDV抗原洗脫條件。[結(jié)果]當(dāng)緩沖液pH為8.0、流速1.2 mL/min、鹽濃度450 mmol/L、上樣體積1.5 mL時(shí)，F(xiàn)MDV抗原的純化效果最佳。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為離子交換層析在FMDV抗原的分離與純化提供依據(jù)。

陰離子交換樹(shù)脂；口蹄疫病毒抗原；純化

口蹄疫(Food and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Food and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄類(lèi)動(dòng)物的急性、熱性、接觸性、烈性傳染病。由于該病的發(fā)生會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和政治影響，因此，口蹄疫的防治工作始終受到世界各國(guó)政府的高度重視[1]。目前，針對(duì)該病的防治主要采用滅活疫苗免疫接種，滅活疫苗一般都是由完整病毒或細(xì)菌經(jīng)滅活劑滅活后制成，其效力與抗原含量、病原體的免疫原性及使用的佐劑有關(guān)。由于FMDV本身抗原性較差，病毒滅活后對(duì)其抗原性的影響較大，所以在生產(chǎn)口蹄疫滅活疫苗時(shí)，尤其是多價(jià)疫苗，如何保證單位使用劑量?jī)?nèi)抗原含量就成為關(guān)鍵問(wèn)題。層析技術(shù)是近代生物化學(xué)最常用的方法之一[2]，其中離子交換層析(Ion exchange chromatography，IEC)是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子可逆交換時(shí)結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法[3-5]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的 pH時(shí)，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白通過(guò)逐步增加洗脫液的鹽濃度或提高洗脫液的 pH將從層析柱上洗脫下來(lái)。筆者從緩沖液pH、鹽濃度、洗脫流速和上樣體積方面對(duì)FMDV抗原進(jìn)行分離與純化，旨在為離子交換層析在FMDV抗原的分離與純化的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑。717離子交換樹(shù)脂，購(gòu)自廣東西隴化工廠(chǎng)(汕頭)；Tris-NaCl緩沖液：10 mmol/L Tris + 300 mmol/L NaCl，將pH分別調(diào)至7.0、7.5和8.0。

1.1.2儀器。Agilent紫外檢測(cè)儀；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)；pH計(jì)(Mettler)。

1.2樣品來(lái)源與前處理由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供口蹄疫病毒滅活抗原，通過(guò)超濾濃縮的方法使樣品濃縮10倍，備用。

1.3樹(shù)脂的預(yù)處理將陰離子交換樹(shù)脂反復(fù)用蒸餾水浸泡至蒸餾水無(wú)色，再分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH交替浸泡3次，用蒸餾水洗至中性。

1.4離子交換層析

1.4.1裝柱。將陰離子交換樹(shù)脂裝入內(nèi)徑為20 mm的玻璃柱，樹(shù)脂層高度600 mm，用蒸餾水將樹(shù)脂沖洗至中性，再用柱體積2倍的起始緩沖液將陰離子交換樹(shù)脂平衡。

1.4.2紫外檢測(cè)儀連接。將陰離子交換樹(shù)脂連接到紫外檢測(cè)儀上，將平衡好的樹(shù)脂在恒定的操作溫度下選用不同流速通過(guò)蠕動(dòng)泵流過(guò)柱，加入一定量經(jīng)處理的濃縮樣品，流出液通過(guò)紫外監(jiān)測(cè)儀連續(xù)測(cè)量溶液中抗原含量，將測(cè)量信號(hào)輸入記錄儀，記錄流出液中蛋白濃度隨流出時(shí)間的變化，用不同濃度的NaCl溶液將目的抗原脫附下來(lái)。

1.5分析方法吸附平衡和洗脫平衡試驗(yàn)中，F(xiàn)MDV濃度的測(cè)定采用紫外分光光度法，測(cè)定溶液在波長(zhǎng)280 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算實(shí)際濃度。FMDV濃縮粗品和層析分離后樣品的純度，通過(guò)146S檢測(cè)、夾心ELISA方法、蛋白檢測(cè)對(duì)比抗原純化效果。

2　結(jié)果與分析

2.1進(jìn)樣量對(duì)FMDV抗原的分離效果的影響在樹(shù)脂高度 600 mm條件下，以 1.5、2.0、3.0 mL 的樣品進(jìn)樣體積進(jìn)行洗脫。由表1可知，當(dāng)進(jìn)樣體積為 1.5 mL時(shí)，F(xiàn)MDV抗原的效價(jià)檢測(cè)和146S檢測(cè)值均明顯高于進(jìn)樣體積為2.0和3.0 mL時(shí)，達(dá)到最好的分離純化效果。隨著進(jìn)樣體積的增大，抗原中各組分的峰值也相應(yīng)增大，但是由于樹(shù)脂的吸附能力已經(jīng)飽和，過(guò)多的進(jìn)樣量不能完全地吸附和洗脫，因此FMDV抗原含量也有所下降。因此，選擇1.5 mL作為進(jìn)樣體積。

表1不同進(jìn)樣體積收集樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 1Detection results of samples collected from different sampling volume

進(jìn)樣量SamplevolumemLELISA效價(jià)ELISAtiter蛋白含量Proteincontentmg/mL146S含量146Scontentμg/mL1.51∶256～1∶1280.27325.982.01∶128～1∶640.39874.233.01∶128～1∶640.36323.67

2.2洗脫液流速對(duì)FMDV抗原分離效果的影響取濃縮抗原樣1.5 mL，在樹(shù)脂高度為 600 mm、分別以 1.0、1.2、1.5 mL/min 的流速進(jìn)行洗脫分離。通過(guò)檢測(cè)層析后所收集樣品的抗原效價(jià)、蛋白含量和146S含量，以1.2 mL/min的流速洗脫時(shí)，檢測(cè)結(jié)果更好(表2)。由此可見(jiàn)，流速為1.2 mL/min時(shí)FMDV抗原的分離效果較好。

表2不同流速收集樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 2Detection results of samples collected at different flow speed

流速FlowspeedmL/minELISA效價(jià)ELISAtiter蛋白含量Proteincontentmg/mL146S含量146Scontentμg/mL1.01∶256～1∶1280.26995.531.21∶512～1∶2560.22766.281.51∶256～1∶1280.27664.89

2.3緩沖液pH對(duì)FMDV抗原分離效果的影響離子交換層析FMDV抗原時(shí)，pH的高低對(duì)FMDV抗原的分離效果也有一定的影響，取濃縮抗原樣1.5 mL，在樹(shù)脂高度為 600 mm、流速為 1.2 mL/min 的條件下，緩沖液pH分別為7.0、7.5、8.0條件下進(jìn)行洗脫。由表3可知，在緩沖液pH為8.0時(shí)，F(xiàn)MDV抗原的分離效果較好。

表3　不同pH收集樣品的檢測(cè)結(jié)果

2.4鹽濃度對(duì)FMDV抗原分離效果的影響采用逐步提高平衡緩沖液中氯化鈉的濃度盡可能使目的抗原與雜蛋白充分分離，從而使FMDV抗原分離效果更好。在樹(shù)脂高度為 600 mm、上樣體積1.5 mL、1.2 mL/min 的洗脫流速和緩沖液pH 8.0的條件下，分別用鹽濃度為100、150、450、600 mmol/L進(jìn)行逐步洗脫，比較經(jīng)檢測(cè)所收集峰值的樣品蛋白含量和146S含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)緩沖液含鹽濃度為450 mmol/L時(shí)對(duì)FMDV抗原的分離效果較好(表4)。

3　討論與結(jié)論

病毒的純化工藝是疫苗制備中的關(guān)鍵技術(shù)，也是直接影響疫苗質(zhì)量最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。早先的一般用于動(dòng)物的病毒性疫苗含有來(lái)源于動(dòng)物組織、細(xì)胞和培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分，易使接種者產(chǎn)生過(guò)敏等不良反應(yīng)[6-7]。通過(guò)采用純化技術(shù)對(duì)疫苗的免疫活性成分(如全病毒或病毒中具有免疫保護(hù)作用的亞單位成分)進(jìn)行純化與分離，去除部分或大部分生物源性雜質(zhì)成分(如動(dòng)物組織、細(xì)胞基質(zhì)和培養(yǎng)基中的雜蛋白、糖類(lèi)、脂類(lèi)及核酸等)，濃縮富集了有保護(hù)或輔助治療作用的抗原成分，避免或降低了疫苗接種后的副反應(yīng)發(fā)生率，使得純化病毒疫苗比傳統(tǒng)粗制疫苗更加安全[8-9]。

表4不同鹽濃度收集樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 4Detection results of samples collected at different salt concentration

鹽濃度Saltconcentrationmmol/LELISA效價(jià)ELISAtiter蛋白含量Proteincontentmg/mL146S含量146Scontentμg/mL1001∶128～1∶640.28545.031501∶128～1∶640.29185.164501∶256～1∶640.22506.786001∶64～1∶320.31784.27

離子交換色譜具有開(kāi)放性支持骨架，大分子可以自由進(jìn)入并迅速擴(kuò)散，多孔，吸附容量大，同時(shí)具有親水性，對(duì)大分子吸附不牢固，用溫和的條件可以洗脫，不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸和多糖的分離純化并獲得了較理想的結(jié)果，是一種高效的蛋白質(zhì)純化方法[10]。在應(yīng)用時(shí)需要考慮多方面的因素，如離子交換劑和緩沖液的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH等。同種電荷的不同離子交換劑側(cè)鏈基團(tuán)具有不同的pKa，固定條件下對(duì)蛋白質(zhì)有不同大小的結(jié)合能力，因此有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)離子交換劑能有效結(jié)合蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)的損失，但洗脫時(shí)需要較高的鹽濃度，或大幅度改變pH[11]。筆者采用陰離子交換層析方法對(duì)FMDV進(jìn)行純化，確定了較理想的上樣量、上樣流速、平衡和過(guò)柱緩沖液的pH和鹽濃度等影響層析純化效果的參數(shù)，為口蹄疫病毒滅活疫苗純化工藝的建立提供了參考。

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Separation and Purification of Foot and Mouth Disease Virus Antigen by Ion Exchange Chromatography

MA Quan-ying, DU Ping, ZHU Xiu-mei et al

(China Agricultural Veterinary Biological Science ang Technology Company Limited, Lanzhou, Gansu 730046)

[Objective] The aim was to separate and purify FMDV antigen by using ion exchange chromatography. [Method] High purity FMDV antigen was prepared by anion exchange resin, through exploration on sample, buffer solution pH, current speed, salt concentration, loading volume of sample, the optimal elution condition of FMDV antigen was determined. [Result] The best condition for purification of FMDV antigen is when buffer pH reached 8.0, flowed at a speed of about 1.2 mL/min, salt concentration was 450 mmol/L and the loading volume of sample was 1.5 mL. [Conclusion] The results can provide basis for separation and purification of FMDV antigen by ion exchange chromatography.

Anion exchange resin; Foot and mouth disease virus antigen; Purification

馬全英(1981- )，女，甘肅蘭州人，助理研究員，碩士，從事分子免疫學(xué)方面的研究。

2016-06-20

S 859

A

0517-6611(2016)22-138-02