牛艷芳， 王飛宇， 陳立紅*， 閆 偉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

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大青山油松根際固氮菌的多樣性研究

牛艷芳1,2， 王飛宇1， 陳立紅1*， 閆 偉2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

[目的]研究大青山油松樹種根際固氮菌的多樣性。[方法]對(duì)從大青山油松(Pinustabulaeformis)根際土壤中分離的固氮菌進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增及序列測(cè)定，應(yīng)用 DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，使用 MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]大青山油松根際土壤中分離的46株固氮菌分屬于Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等11個(gè)不同的類群，其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium為優(yōu)勢(shì)屬種。系統(tǒng)分析表明，大青山油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

大青山；油松；固氮菌；16S rDNA

生物固氮是生物圈氮素的重要來(lái)源，對(duì)于陸地生態(tài)系統(tǒng)具有基礎(chǔ)性作用[1-3]。森林生態(tài)系統(tǒng)作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的主體，在調(diào)節(jié)全球碳平衡和減緩全球氣候變化進(jìn)程中扮演著重要角色，具有其他生態(tài)系統(tǒng)無(wú)可替代的作用[4]。由于近幾十年的開發(fā)和利用，森林、草地、濕地生態(tài)系統(tǒng)均受到了不同程度破壞，造成面積縮小，生態(tài)系統(tǒng)失衡。

大青山位于內(nèi)蒙古呼和浩特市和包頭市一線北側(cè)，屬于陰山山脈中段，地處110°45′52″～111°32′12″E，40°37′41″～40°57′30″N。該區(qū)地處溫帶半干旱區(qū)，屬于大陸性氣候，海拔1 050～2 374 m。大青山是陰山山脈植物種數(shù)最豐富的一段山體，森林覆蓋率為41.65%，土壤類型有淋溶灰褐土、粗骨土、山地栗鈣土、灰褐土和草灌灰褐土等。森林植被包括針葉林和闊葉林，其中針葉林主要樹種有油松、青海云杉、杜松，局部地區(qū)出現(xiàn)華北落葉松，闊葉林主要樹種有白樺、遼東櫟、蒙椴、山楊、山杏[5-6]。內(nèi)蒙古從東到西有大興安嶺—陰山山脈—賀蘭山，這些地區(qū)溫度、適度、降雨量、蒸發(fā)量、土壤類型和植被類型等生態(tài)條件復(fù)雜多變，而針葉樹種落葉松和油松是這些山脈森林地帶的主要樹種，它們?cè)诰S持和改善內(nèi)蒙古生態(tài)環(huán)境中占據(jù)重要地位[7-10]。筆者研究大青山油松樹種根際固氮菌的多樣性，旨在為森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1土樣采集試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古大青山古路板林場(chǎng)人工油松林，地處111°50′40″E，40°58′12″N，坡度16°，海拔1 307 m。該區(qū)地處內(nèi)陸北緯中溫帶，屬于典型的大陸性半干旱季風(fēng)氣候。年平均降水量為350 ～ 450 mm，濕度0.3～0.6，年平均氣溫6 ℃，無(wú)霜期120 d。土壤主要為山地栗鈣土，質(zhì)地多為砂壤和輕壤土，pH在7.0 左右。油松人工林的平均基徑為9.50 cm，平均樹高為549 cm，林齡為21 a[11]。將土壤樣品裝入無(wú)菌的封口袋編號(hào)標(biāo)記，帶回后放置于4 ℃冰箱中冷藏。

1.2固氮菌的分離與純化采用阿須貝培養(yǎng)基(葡萄糖 10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO40.2 g、CaCO35 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2)分離和純化土壤樣品中的固氮菌。稱取10 g土樣，放入裝有90 mL無(wú)菌水的加有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上150 r/min，振蕩20 min,依次制成10-3、10-4、10-53個(gè)不同稀釋度的土壤懸液，分別接種到培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌玻璃棒涂布均勻，28 ℃下恒溫培養(yǎng)6～7 d。將培養(yǎng)出來(lái)的固氮菌菌落采用劃線法進(jìn)行分離，約4～5代后即可分離到純種的固氮菌。將純化后的固氮保存在試管中，置于4 ℃冰箱中備用[12-15]。

1.3固氮菌基因組DNA的提取在1.5 mL滅菌的離心管中加入 500 μL TE 溶液，用無(wú)菌牙簽刮取培養(yǎng)皿上的單菌落溶于TE溶液中。在每個(gè)離心管中加入 50 mg/mL 的溶菌酶3 μL，充分混勻，在 37 ℃下作用 2 h。在每個(gè)離心管中再加入5 mol/L NaCl 30 μL和 20% 的 SDS 30 μL，充分混勻，在 65 ℃下作用 1 h。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，充分混勻，在 12 000 r/min 離心 10 min，此后收集上清液約400 μL于新的滅菌離心管中。加入2倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻，12 000 r/min離心 5 min，收集沉淀。用70%的乙醇洗滌沉淀，之后將乙醇倒掉，用無(wú)菌濾紙吸干離心管中的水分，風(fēng)干后再溶于 50 μL 的 ddH2O中，保存于-20 ℃下。

1.4固氮菌16S rDNA的擴(kuò)增以固氮菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增16S rDNA。PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×)、1.0 μL 10 μmol/L引物27f、1 μL 10 μmol/L引物1492 r，1.0 μL模板DNA，添加9.5 μL ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[16]。

1.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)定的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST同源序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并人工校對(duì)，利用MEGA 4.0軟件計(jì)算Kimura′s two-parameter遺傳距離，并構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)自展一致系統(tǒng)發(fā)育樹，自展重復(fù)總數(shù)為1 000[17]。

2　結(jié)果與分析

2.116S rDNA的擴(kuò)增采用阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基對(duì)采自大青山油松根際土壤中的固氮菌進(jìn)行分離。根據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色以及菌體形態(tài)和大小等特征，分離出57株固氮菌。以細(xì)菌通用引物27f 和1 492r 對(duì)分離菌株的16S rDNA 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，所得片段大小約為1.5 kb(圖1)。

圖1　固氮菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1　The amplified products of 16S rDNA gene from nitrogen-fixing bacteria strains

2.216S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析應(yīng)用 DNAMAN 6.0 軟件對(duì)分離出的菌株和從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的 16S rDNA序列進(jìn)行多序列比對(duì),然后使用MEGA4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-joining method) 構(gòu)建部分分離的固氮菌菌株與相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，呼和浩特大青山油松根際土壤中固氮菌具有非常豐富的多樣性，它們分布于11個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支上。菌株 QS7、QS19、QS30、QS32、QS33、QS36、QS39、QS41、QS50、QS53 等菌株與菌株P(guān)seudomonassp.Ats6 和Pseudomonassp.3-7 聚在一起；菌株 QS25、QS55 和菌株Enterobactersp.D22 聚在一起；菌株 QS14 和菌株Naxibactersp.6981 聚在一起；菌株 QS15 和菌株Burkholderiasp.5AT11 聚在一起；菌株QS1、QS6、QS24、QS261 和菌株Cupriavidusnecatorss1-6-6 聚在一起；菌株QS2、QS54、QS332 和菌株P(guān)hyllobacteriumsophoraeCCBAU 03415 聚在一起；菌株 QS3 和菌株Ensifersp.S16 聚在一起；菌株 QS4、QS27 和菌株AgrobacteriumtumefaciensCh3 聚在一起；菌株 QS31 和菌株ArthrobacterS3.TSA.019 聚在一起；菌株 QS12、QS26與菌株P(guān)aenibacillussp.C-19-1 聚在一起；菌株 QS23、QS29、QS35、QS37 與菌株Bacillussp.DU190(2010) 聚在同一分支上。

圖2　固氮菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from nitrogen-fixing bacteria strains

2.3大青山油松根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)分析利用阿須貝培養(yǎng)基從大青山油松根際土壤中共分離出固氮菌57株，經(jīng)16S rDNA序列鑒定出46株固氮菌。其中，Pseudomonas有11株，占23.91%；Bacillus有7株，占15.22%；Arthrobacter有7株，占15.22%；Phyllobacterium有5株，占10.87%；Paenibacillus有4株，占8.7%；Cupriavidus有4株，占8.7%；Enterobacter有3株，占6.52%；Agrobacterium、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等4個(gè)屬的固氮菌5株，占10.87%。在大青山油松根際土壤中Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Arthrobacter為優(yōu)勢(shì)屬，其數(shù)量從多到少依次為：Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium。

表1　不同固氮菌類群所占比例

3　結(jié)論

結(jié)合菌體形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，從大青山油松根際土壤中分離出46株固氮菌，它們分布于11個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支上。其中，11株屬于Pseudomonas，7株屬于Bacillus，7株屬于Arthrobacter，5株屬于Phyllobacterium，其余18株分屬于Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等7個(gè)不同的屬。大青山油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性，其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium屬于優(yōu)勢(shì)類群。

[1] 張衛(wèi)峰,馬林,黃高強(qiáng),等.中國(guó)氮肥發(fā)展、貢獻(xiàn)和挑戰(zhàn)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(15):3161-3171.

[2] EVANS H J，BURRIS R H.Highlights in biological nitrogen fixation during the last 50 years[C]//STACEY G，BURRIS R H，EVANS H J，et al.Biological nitrogen fixation.New York,London：Chapman & Hall,Inc.,1992.

[3] 王紹友,李季倫.固氮酶催化機(jī)制及化學(xué)模擬生物固氮研究進(jìn)展[J].自然科學(xué)進(jìn)展,2000,10(6)：481-490.

[4] 陳奮飛,莊捷,王逸群.我國(guó)林木固氮的研究現(xiàn)狀和前景展望[J].湖南林業(yè)科技,2006,33(4)：4-7.

[5] 雍世鵬，張全如，趙一之，等.論陰山山脈生物多樣性的特性及其保護(hù)途徑[J].西部資源，2005,30(2):13-15

[6] 樊斌.陰山山脈對(duì)內(nèi)蒙古中部地區(qū)氣象要素影響初探[J].內(nèi)蒙古氣象，2010(1):35-37

[7] 魏強(qiáng),張秋良,代海燕,等.大青山不同林地類型土壤特性及其水源涵養(yǎng)功能[J].水土保持學(xué)報(bào)，2008 ,22(2):111-115.

[8] 陳曉燕,田有亮,包志剛,等.大青山主要植被類型土壤物理特性的研究[J].水土保持通報(bào)，2009,29(5):30-34.

[9] 代海燕,張秋良,張翠霞,等.內(nèi)蒙古大青山主要植被類型綜合生態(tài)效益的評(píng)價(jià)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011,39(5):98-109.

[10] 田海芬，劉華民，王煒，等.大青山山地植物區(qū)系及生物多樣性研究[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2014,28(8):172-177.

[11] 王素英，王海榮，方亮，等.大青山不同森林結(jié)構(gòu)與根際土壤微生物數(shù)量變化研究[J].內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2010,36(2):20-26.

[12] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2001.

[13] 丁延芹,王建平,劉元,等.幾株固氮芽孢桿菌的分離與鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2004,12(6)：690-697.

[14] 凌娟,董俊德,張燕英，等.一株紅樹林根際固氮菌的分離、鑒定以及固氮活性測(cè)定[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010,29(5)：149-153.

[15] 沈萍，陳向東.微生物學(xué)試驗(yàn)[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[16] 田國(guó)杰,王晗,陳立紅.內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)主要樹種根際固氮菌的分離和鑒定[J].內(nèi)蒙古林業(yè)科技,2016,42(1)：21-26.

[17] TAMURA K,DUDLEY J,NEI M，et al.MEGA4：Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA) software version 4.0[J].Molecular biology and evolution,2007,24(8):1596-1599.

Diversity of Nitrogen-fixing Bacteria fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains

NIU Yan-fang1,2,WANG Fei-yu1,CHEN Li-hong1*et al

(1.Agricultural College,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010019; 2.College of Forestry,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010019)

[Objective] The aim was to study diversity of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains.[Method] To amply and sequence 16S rDNA gene of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains,the alignment of 16S rDNA sequences was conducted by DNAMAN 6.0,and the Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA 4 software.[Result] The phylogenetic analysis showed that forty-six isolates fromP.tabulaeformisbelonged to eleven groups,which arePseudomonas,Bacillus,Phyllobacterium,Cupriavidus,Paenibacillus,Enterobacter,Agrobacterium,Arthrobacter,Naxibacter,Burkholderia,Ensifer,andPseudomonas,Bacillus,Arthrobacter,Phyllobacteriumare dominant groups.The results showed that the nitrogen-fixing bacteria fromP.tabulaeformisin Daqing Mountains have rich diversity.[Conclusion] The results can provide theoretical basis for sustainable development of forest ecosystem.

Daqing Mountains;Pinustabulaeformis; Nitrogen-fixing bacteria; 16S rDNA

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260173) 。

牛艷芳(1977- )，女，內(nèi)蒙古包頭人，博士研究生，研究方向:林木生物技術(shù)。*通訊作者，副教授，博士，從事土壤微生物和林木生物技術(shù)研究。

2016-06-20

S 718.8

A

0517-6611(2016)22-001-03