許智慧楊艷萍王晶晶宋勵(lì)師亮景雅

轉(zhuǎn)錄因子TBX3在小鼠胚胎動(dòng)脈囊及弓動(dòng)脈發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)*

許智慧①楊艷萍①王晶晶①宋勵(lì)①師亮①景雅①

目的：探討在小鼠胚胎早期發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子TBX3（T-box transcription factor3）和動(dòng)脈囊發(fā)育的關(guān)系。方法：對(duì)胚齡9～12 d（E9～E12）的小鼠胚胎心做連續(xù)石蠟切片，抗轉(zhuǎn)錄因子TBX3抗體、抗胰島因子-1（ISL-1）抗體、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體對(duì)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果：胚齡9 d，TBX3陽(yáng)性細(xì)胞在呼吸內(nèi)胚層聚集。胚齡10 d，在動(dòng)脈囊和第3對(duì)弓動(dòng)脈連接處可見TBX3陽(yáng)性細(xì)胞。胚齡11 d，在第4、6對(duì)弓動(dòng)脈之間可以觀察到TBX3細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)。胚齡12 d，TBX3陽(yáng)性表達(dá)集中于咽前間充質(zhì)。結(jié)論：傳導(dǎo)系的陽(yáng)性心肌前體細(xì)胞TBX3參與動(dòng)脈囊及弓動(dòng)脈的形態(tài)發(fā)生。

動(dòng)脈囊； 轉(zhuǎn)錄因子TBX3； 胰島素增強(qiáng)子結(jié)合蛋白； 免疫組化；小鼠

First-author's address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

動(dòng)脈囊先后共發(fā)出6對(duì)弓動(dòng)脈，從動(dòng)脈囊發(fā)出延伸至背主動(dòng)脈［1］。6對(duì)弓動(dòng)脈不同時(shí)出現(xiàn)，第1、2對(duì)弓動(dòng)脈很早消失退化，第5對(duì)發(fā)育不全并退化，在小鼠胚胎時(shí)期筆者主要觀察第3、4、6對(duì)弓動(dòng)脈的形成。動(dòng)脈囊位于流出道遠(yuǎn)端，流出道的形態(tài)發(fā)生與動(dòng)脈囊的分隔緊密關(guān)聯(lián)。T-box所含有的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控胚胎發(fā)育的多個(gè)方面，包括心臟的形態(tài)發(fā)生和模式，人類和小鼠缺失或者突變一定數(shù)量的T-box基因會(huì)導(dǎo)致先天性心臟缺陷，小鼠心臟TBX3的表達(dá)最先在心臟循環(huán)開始的流出道被發(fā)現(xiàn)［2-3］。其表達(dá)可以描述發(fā)育中的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)、房室管心內(nèi)膜墊和流出道間質(zhì)，發(fā)育中的心臟轉(zhuǎn)錄因子TBX3主要表達(dá)在中樞傳導(dǎo)系的心肌前體細(xì)胞［4-6］。TBX3表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致心臟畸形，包括房室管細(xì)胞的過(guò)度增殖，心室不完全分隔，右心室雙流出道和主動(dòng)脈弓形成延遲［7］。TBX3基因敲除突變的小鼠除導(dǎo)致中樞傳導(dǎo)系工作心肌異位表達(dá)、心室或心房形成異位節(jié)律點(diǎn)外，還會(huì)引起小鼠流出道出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，包括主動(dòng)脈弓和主肺動(dòng)脈干的異常［8-9］。在以往的報(bào)道中多見第二生心區(qū)ISL-1陽(yáng)性咽前間充質(zhì)細(xì)胞和α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)動(dòng)脈囊的分隔［10-11］。對(duì)TBX3在第二生心區(qū)的時(shí)空表達(dá)雖有描述但與弓動(dòng)脈的形成關(guān)系報(bào)道卻較少。本實(shí)驗(yàn)用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（α-SMA）標(biāo)記發(fā)育中心肌及平滑肌，用ISL-1抗體標(biāo)記心肌前體細(xì)胞，TBX3抗體顯示轉(zhuǎn)錄因子TBX3表達(dá)和動(dòng)脈囊、弓動(dòng)脈發(fā)育的關(guān)系。免疫組織化學(xué)方法觀察3種蛋白質(zhì)在E9～12小鼠胚胎第二生心區(qū)的時(shí)空表達(dá)特征，以探討其在動(dòng)脈囊發(fā)育過(guò)程中的可能作用，為先天性弓動(dòng)脈發(fā)育畸形提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 取足3月齡健康雌性昆明鼠30只，體重22～28 g，在明暗相間12 h條件下飼喂，動(dòng)情期與同種雄鼠于19∶00 合籠，次早晨發(fā)現(xiàn)陰栓者為妊娠0.5 d。乙醚麻醉處理妊娠小鼠收集胚胎，胚齡9 d（E9）胚胎帶子宮固定，其余胚胎子宮內(nèi)剝離出后固定。標(biāo)本固定脫水詳見文獻(xiàn)［12］，石蠟包埋。各胚齡胚胎分別取7只，行7 μm厚連續(xù)切片，每4片取1片做HE染色以便觀察胚胎形態(tài)學(xué)特征，其余心臟切片用于免疫組織化學(xué)染色，多聚賴氨酸處理載玻片。

1.2方法 免疫組織化學(xué)染色PAP法染色，標(biāo)本脫蠟水化后，3%過(guò)氧化氫、TENG-T（Tris 10 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH 8.0）依次各處理40 min，以減低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性和非特異性背景染色。處理后的切片分別用小鼠抗α-SMA單克隆抗體（1∶800，武漢博士德生物工程有限公司），兔抗ISL-l多克隆抗體（1∶120，Abcam公司），山羊抗TBX3多克隆抗體（1∶150，Santa Cruz公司）室溫下過(guò)夜孵育。根據(jù)所孵育一抗的不同，滴加相對(duì)應(yīng)的二抗和三抗，時(shí)間均為2 h，兔過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育1.5 h；DAB顯色，出現(xiàn)呈棕黃色的陽(yáng)性結(jié)果時(shí)滴加蒸餾水終止。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，抗體用PBS（pH 7.4）稀釋。

2　結(jié)果

（1）胚齡9 d，呼吸內(nèi)胚層ISL-1和TBX3細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)并在此聚集，流出道呈管狀，在流出道的遠(yuǎn)段ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞向近段延伸并逐漸表達(dá)α-SMA，見圖1A～C。（2）胚齡10 d，流出道進(jìn)一步增長(zhǎng)，陽(yáng)性α-SMA細(xì)胞延伸至心包腔的背側(cè)壁與臟壁中胚層返折處，見圖2C。咽內(nèi)胚層中ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，鰓弓核心間充質(zhì)ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞增殖添加到動(dòng)脈囊和第3對(duì)弓動(dòng)脈連接處，見圖2A）。咽兩側(cè)TBX3細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在動(dòng)脈囊和第3對(duì)弓動(dòng)脈相交接處出現(xiàn)TBX3和ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞，見圖2A、2B～2E。（3）胚齡11d，α-SMA由流出道延伸至整個(gè)動(dòng)脈囊壁，見圖3C。ISL-1陽(yáng)性咽前間充質(zhì)細(xì)胞圍繞呼吸內(nèi)胚層形成對(duì)稱的特征性錐體形結(jié)構(gòu)，經(jīng)動(dòng)脈囊背側(cè)壁伸入動(dòng)脈囊腔，形成主肺動(dòng)脈隔原基（圖3A），在該椎體結(jié)構(gòu)有TBX3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（圖3B）［13］。隨著第二生心區(qū)間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的增加，TBX3陽(yáng)性細(xì)胞在咽前間充質(zhì)中明顯增多（圖3E），ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞不斷的增殖添加到錐體結(jié)構(gòu)，錐體結(jié)構(gòu)縱向延長(zhǎng)（圖3D），動(dòng)脈囊腹側(cè)壁向腔內(nèi)橫向突起，兩者共同將動(dòng)脈囊分隔，形成第4、6對(duì)弓動(dòng)脈；在第4、6對(duì)弓動(dòng)脈之間未見ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞（圖3D），但可見明顯的TBX3陽(yáng)性細(xì)胞（圖3E、3G）。（4）胚齡12 d，流出道縮短，動(dòng)脈囊分隔為升主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈干，流出道遠(yuǎn)端α-SMA表達(dá)止于大動(dòng)脈根部見圖4A～4C（da：背主動(dòng)脈；ph：咽；as：動(dòng)脈囊；o：流出道；3：第3對(duì)弓動(dòng)脈；fg：前腸；4：第4對(duì)弓動(dòng)脈；6：第6對(duì)弓動(dòng)脈；d：流出道遠(yuǎn)段；a：升主動(dòng)脈；pt：肺動(dòng)脈干；aps：主肺動(dòng)脈隔）。

圖1　胚齡9 d心橫切面注：1A示ISL-1陽(yáng)性表達(dá)，1B示TBX3陽(yáng)性表達(dá)，1C示α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，↑流出道遠(yuǎn)段α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)尺示200 μm。

圖2　胚齡10 d心橫切面注：2A示ISL-1陽(yáng)性表達(dá)，↑示動(dòng)脈囊和第3對(duì)弓動(dòng)脈連接處；2B示TBX3陽(yáng)性表達(dá)，↑示動(dòng)脈囊和第3對(duì)弓動(dòng)脈連接處；2C示陽(yáng)性α-SMA細(xì)胞延伸至心包腔的背側(cè)壁與臟壁中胚層返折處；2D、2E分別是2A、2B的放大，2A、2B標(biāo)尺示200μm，2C標(biāo)尺示500μm，2D、2E標(biāo)尺示100μm。

圖3　胚齡11 d心橫切面注：3A、3B分別示ISL-1、TBX3陽(yáng)性表達(dá)，↑示ISL-1陽(yáng)性咽前間充質(zhì)細(xì)胞圍繞呼吸內(nèi)胚層形成對(duì)稱的特征性錐體形結(jié)構(gòu)；3C示α-SMA陽(yáng)性表達(dá)；3D示ISL-1陽(yáng)性表達(dá)，↑示主肺動(dòng)脈隔；3E示TBX3陽(yáng)性表達(dá)`，↑示第4、6弓動(dòng)脈間；3G為E的放大，3A～F標(biāo)尺示200μm；3G標(biāo)尺示100μm

圖4　胚齡12 d心橫切面注：3A示ISL-1陽(yáng)性表達(dá)，3B示TBX3陽(yáng)性表達(dá)，3C示α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，標(biāo)尺示500μm

3　討論

22q11.2染色體缺失綜合征（22q11.2DS），其特征為咽管和心臟發(fā)育異常；而在22q11.2DS經(jīng)常觀察到的是心血管畸形，其中最為常見的是流出道畸形，流出道的發(fā)育和分隔缺陷會(huì)造成圓錐動(dòng)脈干和室間隔先天性心臟畸形［9］。編碼基因的T-box轉(zhuǎn)錄因子與22q11.2DS密切相關(guān)，T-box家族成員TBX2 和TBX3是調(diào)節(jié)流出道發(fā)育和咽的發(fā)生所必須［14］。相關(guān)研究表明，TBX3基因突變?cè)谌祟悓?dǎo)致尺骨-乳腺綜合征［15-16］。TBX3基因敲除的小鼠，會(huì)引起小鼠流出道出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，包括主動(dòng)脈弓和肺動(dòng)脈干的異常［9］。流出道的遠(yuǎn)端與動(dòng)脈囊相延續(xù)，在胚胎心臟早期流出道分隔開始于動(dòng)脈囊。在咽前間質(zhì)中表達(dá)的TBX3陽(yáng)性細(xì)胞和心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞共同填充流出道并參與流出道的分隔［17］。呼吸內(nèi)胚層向腹側(cè)的延伸可對(duì)流出道正常分隔，以及誘導(dǎo)ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞正常遷移［18］。轉(zhuǎn)錄因子ISL-1是第二生心區(qū)心前體細(xì)胞良好的標(biāo)記蛋白，ISL-1基因敲除小鼠胚胎心流出道、右心室及大部分心房組織缺失，胚胎死于10.5 d［19］。因此以ISL-1的遷移做參照，觀察TBX3的表達(dá)可以進(jìn)一步說(shuō)明其對(duì)動(dòng)脈囊的作用。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，胚齡9 d時(shí)TBX3的陽(yáng)性表達(dá)主要集中在呼吸內(nèi)胚層上，同時(shí)在該區(qū)域有ISL-1的陽(yáng)性表達(dá)，筆者已知ISL-1和多種細(xì)胞信號(hào)及轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控第二生心區(qū)的發(fā)育、增生和細(xì)胞特異性的保持［19-20］。并有數(shù)據(jù)表明，TBX3可能間接控制流出道發(fā)育，通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)途徑協(xié)調(diào)第二生心區(qū)的增殖和分布［9］。呼吸內(nèi)胚層細(xì)胞的數(shù)目會(huì)隨著胚胎心臟發(fā)育不斷增殖并對(duì)流出道分隔，提示TBX3陽(yáng)性細(xì)胞一定時(shí)間內(nèi)在呼吸內(nèi)胚層會(huì)與ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞同步表達(dá)。

胚齡10～11 d時(shí)，呼吸內(nèi)胚層TBX3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，同時(shí)咽兩側(cè)鰓弓出現(xiàn)TBX3陽(yáng)性細(xì)胞。鰓弓核心間充質(zhì)細(xì)胞向動(dòng)脈囊腔增殖，在動(dòng)脈囊與第3對(duì)弓動(dòng)脈的連接處可以觀察到TBX3的陽(yáng)性細(xì)胞。由于ISL-1陽(yáng)性細(xì)胞在動(dòng)脈囊腔構(gòu)成的錐體結(jié)構(gòu)向下延伸，動(dòng)脈囊被進(jìn)一步分隔；分隔后的動(dòng)脈囊形成第4、6對(duì)弓動(dòng)脈，兩者之間可明顯觀察到有TBX3陽(yáng)性細(xì)胞。研究報(bào)道用在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的等位基因Cx40-eGFP標(biāo)記弓動(dòng)脈連接處的TBX3-/-，在流出道與第3、4對(duì)弓動(dòng)脈連接的地方可見其表達(dá)，胚胎中異常的弓動(dòng)脈可以觀察到TBX3的一個(gè)子集［9，21-22］。TBX3的缺失除會(huì)延遲弓動(dòng)脈的形成，還會(huì)影響已知調(diào)節(jié)流出道伸長(zhǎng)的其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如：骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)促進(jìn)第二生心區(qū)動(dòng)脈極的發(fā)生和BMP4在流出道遠(yuǎn)端表達(dá)都被降低，從而進(jìn)一步影響流出道的形態(tài)發(fā)生［9］。結(jié)果提示，除ISL-1間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)動(dòng)脈囊的分隔外，TBX3也參與動(dòng)脈囊及弓動(dòng)脈的形態(tài)發(fā)生。

胚齡12 d時(shí)，升主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈干壁內(nèi)可見ISL-1陽(yáng)性間充細(xì)胞，腔內(nèi)可見α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，主肺動(dòng)脈隔以及升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干開始向平滑肌分化，由此筆者可知TBX3對(duì)動(dòng)脈囊及弓動(dòng)脈的影響主要在早期胚胎發(fā)育過(guò)程。結(jié)合上述的研究和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可為動(dòng)脈囊及弓動(dòng)脈的發(fā)生提供進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

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Expression of the Transcription Factor TBX3 during Development of Mouse Embryonic Aortic Sac and Arch Arteries

XU Zhi-hui，Y ANG Y an-ping，WANG J ing-jing，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（19）：014-017

Objective：To explore the relationship between transcription factor TBX3（ T-box transcription factor3） and the development of aortic sac in the during early development mouse embryo.Method：Serial paraffin sections of mouse embryonic hearts form embryonic 9 days to 12 days（E9-E12） were stained with antibodies against T-box transcription factor3（TBX3），islet-1（ISL-1） and α-smooth muscle actin（ α-SMA ）by the immunohistochemical method.Result：At embryonic 9 days，TBX3 positive cells gathered in the pulmonary endoderm.At embryonic 10 days，we could observe that there TBX3 positive cells at the communication between aortic sac and third arch artery.At embryonic 11 days，communication between the fourth and sixth arch arteries observed TBX3 positive expression.At embryonic 12 days，TBX3 positive expression was mainly focused on pharyngeal mesenchymal.Conclusion：The cardiac conduction system of positive precursor cells TBX3 involved in aortic sac and arch arteries morphogenesis.

Aortic sac； Transcription factor TBX3； Islet-1； Immunohistochemistry； Mouse

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.19.004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（3077114l，31200899）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

景雅

2016-04-29） （本文編輯：周亞杰）