陽靜陳麗瓊?cè)~中綠劉麗麗

PM2.5對兒童骨髓基質(zhì)細胞增殖及細胞因子G-CSF、GM-CSF分泌的影響*

陽靜①陳麗瓊①葉中綠②劉麗麗①

目的：研究大氣細顆粒物（PM2.5）對兒童骨髓基質(zhì)細胞（BMSCs）增殖及細胞因子分泌的影響，探討PM2.5對兒童骨髓造血微環(huán)境的影響。方法：采用不同濃度的PM2.5溶液染毒提取后培養(yǎng)的BMSCs，檢測BMSCs增殖和粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌量及mRNA表達水平。結(jié)果：隨著PM2.5溶液濃度增加，BMSCs增殖逐漸增強，溶液濃度達到50μg/mL后BMSCs增殖水平逐漸下降，20μg/mL時試驗組BMSCs的OD值各時間段均高于對照組，而100μg/mL時均低于對照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低濃度（10、20μg/mL）PM2.5顯著促進BMSCs分泌G-CSF、GM-CSF及mRNA表達，高濃度（50、100、200μg/mL）PM2.5抑制BMSCs分泌G-CSF、GM-CSF及mRNA表達，且濃度達到100μg/mL以上時，抑制效果達到顯著水平。結(jié)論：高濃度PM2.5對兒童BMSCs具有一定的毒性作用。

大氣細顆粒物； 骨髓基質(zhì)細胞； 增殖； 細胞因子

First-author's address：Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China

PM2.5是指空氣動力學直徑小于2.5 μm的細顆粒物質(zhì)，是我國霧霾天氣頻發(fā)的“罪魁禍首”。納米特性賦予其強大的黏附性，極易吸附多環(huán)芳烴等有機污染物和重金屬組成復合物，導致所有可能的化學毒性［1］。長期暴露于PM2.5中可引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等多器官功能損害，增加心血管疾病的死亡率及肺癌的發(fā)生率，國際癌癥研究署已將大氣污染物定義為人類致癌物［2-7］。國外流行病學調(diào)查顯示，兒童白血病的發(fā)生與出生后交通相關顆粒物的暴露有確切的聯(lián)系［8］。白血病是由于造血干/祖細胞分化阻滯、凋亡障礙而使細胞停滯在不同的造血階段并惡性增殖的一類造血干細胞克隆性疾病，骨髓基質(zhì)細胞是起源于胚胎發(fā)育的間充質(zhì)干細胞，和其分泌的細胞因子一起具有黏附造血干/祖細胞，并支持造血細胞增殖、分化、發(fā)育、成熟、遷移、定居、釋放、凋亡，是造血微環(huán)境中重要組成成分，為血液系統(tǒng)惡性疾病的重要參與者［9］。本研究以健康兒童骨髓基質(zhì)細胞（BMSCs）為研究對象，探討PM2.5對BMSC增殖、細胞因子分泌的影響，為環(huán)境污染與血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展關系提供理論基礎。

1　資料與方法

1.1一般資料 骨髓由廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學中心血液組提供，試驗選用2014年4月-2015年2月來本科體檢后排除疾病的正常兒童骨髓。

1.2主要試劑和儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（南美血，HyClone公司），Cell Counting Kit-8 （CCK-8試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所），細胞裂解液（廣州化學試劑廠），ELISA試劑盒（eBioscience公司），RNA提取試劑盒，Real-time PCR試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKALA公司），淋巴細胞分離液（天津灝洋生物），SNP1-PM10/PM2.5空氣采樣儀（美國AT公司），PM2.5重量分析纖維濾膜，超聲震蕩清洗儀，丹尼酶標儀（MK-3丹麥），EPLICSXL流式細胞儀（美國Coulter公司），LightCycler480Ⅱ全自動熒光定量PCR儀（瑞士羅氏），UVP凝膠自動成像系統(tǒng)、水平瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad公司），高速冷凍離心機（Eppendorf 公 司 ），Beckman Coulter DU（ 美 國Beckman），520UV/Vis Spectrophotometer（Coulter公司）。

1.3方法

1.3.1PM2.5的采集和制備 選取湛江市廣東醫(yī)學院校門口（車流量大、污染較重）為采樣點，應用智能TSP中流量采樣器采集2014年3-8月的大氣PM2.5于專用質(zhì)量分析纖維濾紙上，洗脫、過濾，真空冷凍干燥成干粉，收集干粉于-20 ℃保存、備用。使用前采用倍比稀釋的方法配成終濃度0μg/mL 的PM2.5溶液備用為對照組，試驗組為終濃度10、20、50、100、200μg/mL的PM2.5溶液備用。

1.3.2骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng) 無菌條件下，用肝素化的20 mL注射器從志愿者髂后上棘抽取3 mL骨髓，高糖DMEM培養(yǎng)基等比稀釋后，加入淋巴細胞分離液。離心，吸取第二層環(huán)狀乳白色的單核細胞，洗滌、離心、棄上清。用15%胎牛血清高糖DMEM液體培養(yǎng)基重懸細胞，至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液1～2 d/次，待細胞長滿85%～90%融合時，即予以1∶2～1∶3的比例進行傳代處理。取2代培養(yǎng)細胞用流式細胞儀檢測細胞抗原表達情況，鑒定BMSCs，試驗選用第2～3代細胞作為實驗對象。

1.3.3CCK-8法檢測骨髓基質(zhì)細胞的增殖 收集生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄原有培養(yǎng)基換無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后棄上清。分組加入PM2.5，培養(yǎng)12、24、48 h后，CCK-8法檢測細胞增殖。

1.3.4ELISA法 檢 測BMSCs細胞 因 子G-CSF、GM-CSF分泌情況 分別檢測24 h后各組細胞因子G-CSF、GM-CSF的分泌量。以標準品的濃度為縱坐標、標準孔及空白孔的OD值為橫坐標，繪出標準曲線，計算出該標準曲線的回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品的濃度，即為樣品的實際濃度。

1.3.5RT-PCR法檢測BMSCs細胞因子G-CSF、 GM-CSF的mRNA表達水平 用RealTime-PCR法檢測PM2.5作用于BMSCs 24 h后各組細胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA的表達水平。本試驗根據(jù)Ct值，用Delta-deltaCt相對定量的分析方法對實驗結(jié)果進行分析，ΔCt試驗組=Ct實驗目的基因-Ct實驗內(nèi)參；ΔCt對照組=Ct對照目的基因-Ct對照內(nèi)參；ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組，最后計算2-ΔΔCt的結(jié)果作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，表明試驗組和對照組的相對倍數(shù)關系，每個樣本濃度設3平行。

1.4統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用方差（LSD）分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1PM2.5對BMSCs增殖的影響 同一時間與對照組比較，試驗組在10、20μg/mL濃度范圍內(nèi)，BMSCs增殖逐漸增強；50μg/mL后，BMSCs的增殖水平逐漸下降，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此說明低濃度的PM2.5促進BMSCs增殖，而高濃度PM2.5則抑制BMSCs增殖增值，見表1、圖1。

表1　PM2.5對BMSCs增殖OD值的影響（±s）

表1　PM2.5對BMSCs增殖OD值的影響（±s）

*與對照組比較，P＜0.05

組別　濃度　12 h　24 h　48 h對照組（n=3）　0μg/mL　0.959±0.028　0.881±0.013　0.787±0.012試驗組（n=3）10μg/mL　1.087±0.056*1.025±0.015*0.959±0.014*20μg/mL　1.304±0.118*1.224±0.034*1.154±0.024*50μg/mL　0.812±0.008*0.756±0.020*0.670±0.013*100μg/mL　0.710±0.011*0.628±0.008*0.547±0.021*200μg/mL　0.590±0.026*0.523±0.022　0.475±0.040*

圖1　PM2.5對BMSCs增殖影響曲線圖

2.2PM2.5對BMSCs細 胞 因 子G-CSF、GMCSF分泌的影響 用不同濃度的PM2.5溶液作用于BMSC 24 h后，試驗組10、20μg/mL的BMSCs分泌細胞因子G-CSF、GM-CSF增多，50、100、 200μg/mL的BMSCs細胞因子G-CSF、GM-CSF分泌減少；試驗組中20μg/mL處理下的G-CSF、GM-CSF均高于對照組，而100μg/mL以上則低于對照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2　PM2.5對BMSCs細胞因子作用24 h后GM-CSF、G-CSF分泌量的影響（±s） pg/mL

表2　PM2.5對BMSCs細胞因子作用24 h后GM-CSF、G-CSF分泌量的影響（±s） pg/mL

*與對照組比較，P＜0.05

組別　濃度　GM-CSF　G-CSF對照組（n=3）　0μg/mL　128.412±2.104　73.149±1.045試驗組（n=3）10μg/mL　172.251±1.703*94.304±0.231*20μg/mL　268.163±3.581*115.459±2.370*50μg/mL　107.176±3.081*65.241±1.720*100μg/mL　89.182±1.353*34.394±0.935*200μg/mL　81.302±0.948*21.012±0.103*

圖2　不同濃度PM2.5對BMSCs細胞因子GM-CSF、G-CSF分泌量的影響曲線圖

2.3對BMSCs細 胞 因 子G-CSF、GM-CSF的mRNA表達水平的影響 用不同濃度的PM2.5作用于BMSCs 24 h后，與對照組比較，試驗組低濃度PM2.5溶液促進BMSCs細胞因子G-CSF、GM-CSF 的mRNA表達，高濃度抑制BMSCs細胞因子G-CSF、GM-CSF的 mRNA表達。其中 10、20μg/mL處理下G-CSF、GM-CSF的mRNA相對表達量均高于對照組，而200μg/mL處理則顯著低于對照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖3～4。

表3　PM2.5作用于BMSCs 24 h后G-CSF、GM-CSF的mRNA相對表達量（±s）

表3　PM2.5作用于BMSCs 24 h后G-CSF、GM-CSF的mRNA相對表達量（±s）

*與對照組比較，P＜0.05

組別　濃度　GM-CSF　G-CSF對照組（n=3）　0μg/mL　1.000±0.000　1.000±0.000試驗組（n=3）10 μg/mL　3.558±0.111*1.305±0.039*20 μg/mL　5.211±0.167*1.570±0.104*50 μg/mL　2.528±0.153*0.809±0.074*100 μg/mL　0.8367±0.041*0.680±0.095*200 μg/mL　0.533±0.008*0.456±0.099*

3　討論

鄭燦軍等［10］用PM2.5染毒原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞，發(fā)現(xiàn)其存活率隨染毒濃度升高而上升，在10μg/mL時達到最高，隨后隨濃度的升高而降低，觀察到PM2.5及其組分對心肌細胞的hormosis效應［11］。賈巧玉等［12］用不同質(zhì)量濃度的PM2.5作用于人肺成纖維細胞后，也發(fā)現(xiàn)對細胞的增殖有雙向刺激作用，即低濃度刺激、高濃度抑制的作用。本實驗結(jié)果與其有相似之處，都是發(fā)現(xiàn)PM2.5低濃度對細胞存在正性效應，高濃度則是負性效應，這遵循大多數(shù)毒理學研究規(guī)律，即hormosis效應。低濃度PM2.5溶液促進BMSCs細胞因子G-CSF、GM-CSF的分泌和mRNA表達，原因可能是低濃度的PM2.5在刺激BMSCs增殖后，短時間內(nèi)BMSCs細胞數(shù)目增加，進而引起了細胞因子分泌的增加，也可能是G-CSF、GM-CSF等一系列因子分泌增加促進了BMSCs的增殖。GM-CSF被認為是一種與組織再生和/或修復有關的細胞因子，在體外能誘導集落形成，能夠刺激DNA合成，與BMSCs表面受體結(jié)合后刺激細胞增殖［13-14］。G-CSF在對骨髓干細胞的動員過程中涉及到細胞生長因子、黏附分子和趨化因子的相互調(diào)節(jié)作用，并且通過改變骨髓干細胞與BMSCs之間的相互作用，從而影響造血干細胞的黏附、遷移和定居，研究證明G-CSF可動員造血干細胞從骨髓進入外周血，并能同時動員造血干細胞和基質(zhì)細胞的能力［15］。

圖3　不同濃度PM2.5對G-CSF mRNA表達的影響

圖4　不同濃度PM2.5對GM-CSF mRNA表達的影響

PM2.5低濃度刺激及高濃度抑制作用均能導致BMSCs增殖及其細胞因子分泌異常，不管何種作用，對骨髓造血微環(huán)境均產(chǎn)生影響，若是造血干細胞存在異常分化，長時間暴露于PM2.5中，可能促進細胞異常分化表達，成為惡性血液疾病的催化劑，尤其是高濃度的PM2.5對細胞毒性作用更大。PM2.5的毒性作用可能與其導致的氧化應激損害密切有關，PM2.5含有多種重金屬及有毒有害物質(zhì)，其多種成分具有氧化性，可以促使機體產(chǎn)生活性氧、活性氮和氧自由基，通過直接或間接作用激活靶細胞的氧化反應信號通路，從而最終引起各種生物效應［16］。其通過肺血屏障進入血液循環(huán)，激活細胞內(nèi)氧化反應，觸發(fā)多種信號轉(zhuǎn)導途徑，如P21Ras、P38MAPK、ERK-1/2MAPK、Smads/src激酶，引起細胞損傷，細胞因子分泌紊亂，最終造成細胞增殖、分化或死亡等不同結(jié)局［17］。相關研究報道通過氣管滴注PM2.5染毒小鼠造模，證明PM2.5在動物體內(nèi)可通過氧化應激反應抑制小鼠骨髓基質(zhì)細胞增殖，可能與激活AKt信號通路有關，且通過對BMSCs抗氧化預處理可減少對BMSCs的增殖抑制，論證了PM2.5對骨髓的毒性作用［18］。敖當?shù)龋?9］研究PM2.5對大鼠血管平滑肌細胞增殖及NO和內(nèi)皮素分泌的影響，亦推測可能與PM2.5引起細胞氧化應激反應導致NF-κB等炎癥因子異常增高有關。研究表明顆粒物的不同組分均對肺泡Ⅱ型上皮細胞（MLE-12細胞）活力具有顯著的抑制作用，可顯著升高胞內(nèi)過氧化氫（H2O2）［20］。通過誘導人肺上皮A549細胞自噬相關蛋白Atg5和自噬基因Beclin1的mRNA表達誘導細胞自噬反應，可誘導胞外LDH釋放和胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，且成時間—濃度依賴性［21］。正常情況下，造血干細胞主要定位于骨髓的低氧環(huán)境中，低氧環(huán)境限制了ROS的產(chǎn)生，使得造血干細胞能夠免受長期的氧化損傷作用，保證正常的造血功能，一旦造血微環(huán)境低氧環(huán)境被破壞，必將影響造血干細胞正常的造血功能。

PM2.5作用于BMSCs后對其增殖、細胞因子分泌的影響，破壞了骨髓微環(huán)境平衡。研究表明高濃度影響更大，說明了PM2.5對BMSCs具有一定毒性，但其具體機制尚需進一步的研究。

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Effects of PM2.5 on the Proliferation and Secretion Levels of G-CSF and GM-CSF in Children's BMSCs

YANG J ing，CHEN Li-qiong，YE Zhong-lv，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（19）：005-009

Objective：To observe the effects of ambient particulate matter （PM2.5） on the proliferation and secretion levels of cytokines of children's bone marrow stromal cells （BMSCs） and to explore the effects of PM2.5 on children's bone marrow hematopoietic microenvironment.Method：The collected BMSCs were exposed to different concentration of PM2.5 solutions.The proliferation of BMSCs and the secretion levels of G-CSF，GM-CSF and mRNA were detected.Result：The BMSCs proliferation increased with the increase of concentration of PM2.5 solution，after 50μg/mL the proliferation of BMSCs level gradually decline.The proliferation of BMSCs level with concentration 20μg/mL of experimental group was significantly higher than control，while 100μg/mL of experimental group was significantly lower than control group，the differences were statistically significant （P＜0.05）.The low concentration of PM2.5 with 10 and 20μg/mL promoted the secretion levels of G-CSF，GM-CSF and mRNA，while gradually inhibited in the PM2.5 concentration of 50，100 and 200μg/mL.The concentration reaches more than 100μg/mL，inhibiting effects reached significant level.Conclusion：The high concentration of PM2.5 has a certain toxic effect on children's BMSCs.

Ambient particulate matter； Bone marrow stromal cells； Proliferation； Cytokines

廣東省科技計劃項目（40101S010004）；廣東湛江市重點科技專項（2013A304）

①廣東醫(yī)學院 廣東 湛江 524001

②廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院

陽靜

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.19.002

2016-03-31） （本文編輯：周亞杰）