吳百平，張永剛

(廣饒縣中醫(yī)院兒科，山東 東營(yíng) 257300)

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探究CD4+T細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義

吳百平，張永剛

(廣饒縣中醫(yī)院兒科，山東 東營(yíng) 257300)

目的探究CD4+T細(xì)胞四大亞群及淋巴細(xì)胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義。方法以2011年9月至2014年9月在廣饒縣中醫(yī)院兒科進(jìn)行治療的哮喘患兒100例作為研究組，選取同期進(jìn)行健康體檢的兒童100例作為對(duì)照組。兩組兒童均在早晨空腹情況下抽取靜脈血5mL于3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本處理，利用流式細(xì)胞儀器測(cè)量外周血中Th1、Th2、Th17、外周血Treg及淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果研究組患兒外周血Treg占CD4+T細(xì)胞的比率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.01，P<0.05)；Th1占CD4+T細(xì)胞的比率在兩組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.03，P>0.05)；Th2占CD4+T細(xì)胞的比率明顯高于對(duì)照組(t=5.32，P<0.05)；Th17占CD4+T細(xì)胞的比率明顯高于對(duì)照組(t=6.94，P<0.05)。研究組CD3+所占百分率明顯低于對(duì)照組(t=4.56，P<0.05)；研究組CD4+所占百分率的水平均明顯低于對(duì)照組(t=5.61，P<0.05)；研究組CD8+所占百分率明顯低于對(duì)照組(t=5.04，P<0.05)；研究組CD16+56+的水平均明顯低于對(duì)照組(t=6.77，P<0.05)。兩組間的白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組淋巴細(xì)胞百分比較對(duì)照組低(t=7.99，P<0.05)；嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組(t=12.58，P<0.05)；單核細(xì)胞百分比的水平均明顯高于對(duì)照組(t=12.06，P<0.05)。結(jié)論CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子(Th1/Th2/Th17)、Treg及淋巴細(xì)胞亞群可作為判斷哮喘免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)疾病的診斷、預(yù)防、治療以及療效的評(píng)價(jià)都具有重要臨床意義。

哮喘；淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞技術(shù)；CD4+細(xì)胞亞群

[Abstract]ObjectiveToexploretheclinicalsignificanceoffoursubsetsofCD4+Tcellsandlymphocytesubsetsinchildrenwithasthma.MethodsFromSeptember2011toSeptember2014 100childrenwithasthmatreatedinGuangraoCountyTCMHospitalwererecruitedinstudygroup,andanother100childrentakinghealthphysicalexaminationatthesameperiodwereselectedincontrolgroup.Fastingvenousbloodsamples(5mL)werecollectedinthemorninginchildrenofbothgroups,andtheywereprocessedwithin3hours.FlowcytometryinstrumentwasusedtomeasureperipheralbloodTh1,Th2,Th17,Tregandlymphocytesubsets.ResultsInthestudygroupthepercentageofperipheralbloodTreginCD4+Tcellswassignificantlyhigherthaninthecontrolgroup(t=4.01, P<0.05).TherewasnosignificantdifferenceinpercentageofTh1inCD4+Tcellsbetweentwogroups(t=1.03, P>0.05).ThepercentageofTh2andTh17wasobviouslyhigherthanthecontrolgroup(tvaluewas5.32and6.94,respectively,bothP<0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thepercentageofCD3+,CD4+,CD8+andCD16+56+wassignificantlylowerinthestudygroup(tvaluewas4.56, 5.61, 5.04and6.77,respectively,allP<0.05).ThedifferencesinratiosofWBCandneutrophilswerenotsignificant(bothP>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,thepercentageoflymphocytewaslowerbutthatofeosinophilandmonocytewashigherinthestudygroup(tvaluewas7.99, 12.58and12.06,respectively,allP<0.05).Conclusioncytokines(Th1/Th2/Th17),TregandlymphocytesubsetsinCD4+Tlymphocytes,canbetakenasjudgmentstandardforasthmaimmuneresponse,whichareimportanttovaluatethediagnosis,prevention,treatmentandcurativeeffectofdiseases.

[Keywords]asthma;lymphocytesubsets;flowcytometrytechnology;CD4+cellssubset

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，主要特征包括氣道慢性炎癥，氣道對(duì)多種刺激因素呈現(xiàn)高反應(yīng)性，廣泛多變的可逆性氣流受限以及隨著病程延長(zhǎng)而導(dǎo)致的一系列氣道結(jié)構(gòu)的改變及氣道重構(gòu)[1-2]。很多哮喘患兒因?yàn)橹委煵患皶r(shí)或是治療方法不當(dāng)最終遷延成為成人哮喘，導(dǎo)致肺功能嚴(yán)重?fù)p傷，一些患兒甚至完全失去勞動(dòng)能力。兒童與成人基本上相似，但兒童和成人哮喘在某些方面仍然存在著差異。哮喘患兒由于正處于生理、心理、智能及免疫系統(tǒng)，尤其是在免疫學(xué)和病理生理學(xué)方面[3-4]不斷發(fā)育成長(zhǎng)階段。本研究的目的在于探討利用流式細(xì)胞檢測(cè)儀測(cè)量哮喘兒童外周靜脈血中的Th1、Th2、Th17、Treg及淋巴細(xì)胞亞群[5]。結(jié)合臨床相關(guān)因素，分析各檢測(cè)因子在小兒哮喘患兒免疫方面的異同，從而探索CD4+T細(xì)胞四大亞群及淋巴細(xì)胞亞群在小兒哮喘中的意義。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

研究組：選取2011年9月至2014年9月在廣饒縣中醫(yī)院兒科進(jìn)行哮喘治療的100例患病兒童,其中男孩54例，女孩46例;年齡3～12歲，平均(6.6±3.5)歲。診斷以中華醫(yī)學(xué)兒科分會(huì)呼吸學(xué)組制定的哮喘防治常規(guī)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)；試驗(yàn)前兩周均未使用過茶堿、免疫球蛋白、糖皮質(zhì)激素、色甘酸鈉、白三烯拮抗劑等免疫調(diào)節(jié)藥物；排除伴有其他心肺疾病、自身免疫疾病史、腫瘤等惡性疾病史的患兒。

對(duì)照組：同期本院兒童保健門診正常健康體檢的兒童100例,年齡4～11歲，平均(5.8±2.2)歲;男56例，女44例。排除伴有其他心肺疾病、自身免疫疾病史、腫瘤等惡性疾病史的患兒；均無(wú)自身過敏及過敏性家族史。

兩組兒童在年齡、性別等一般資料上，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集

哮喘患兒入院時(shí)，用肝素鈉抗凝負(fù)壓真空方法采取其清晨空腹靜脈血5mL，在3h內(nèi)檢測(cè)。對(duì)照組患兒則采用其進(jìn)行微量元素檢測(cè)的余血。

1.2.2T淋巴細(xì)胞Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞因子檢測(cè)

刺激細(xì)胞：按順序在流式管中加入PMA5μL、離子霉素1μL、BFA1μL、外周全血500μL，混勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4～6h。標(biāo)記管：標(biāo)記IFN-γ/IL-4抗體管、IFN-γ/IL-4對(duì)照管、IL-17抗體管，IL-17對(duì)照管。固定/破膜及細(xì)胞打孔：將全血200μL置于4管中，在4管中分別加固定/破膜稀釋液2mL/管，混勻，于4℃避光保存40min后，在室溫下(20～25℃)離心10min，轉(zhuǎn)速2 000r/min；棄去上清，再在每個(gè)管中加入固定/破膜洗滌液1mL，混勻，離心，棄去上清。胞膜內(nèi)免疫熒光標(biāo)記：在各管中均加5μLCD4-APC后，在抗體管中加入小鼠抗人IFN-γ/IL-4及IL-17APE單克隆抗體，同型管中加入相應(yīng)同型對(duì)照20μL/管，混勻，于4℃避光保存30min。加固定/破膜洗滌液2mL/管，離心，棄上清。流式細(xì)胞儀檢測(cè)：在每管中加入PBS400μL，混勻，上機(jī)檢測(cè)。T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)按照MulttestIMK的四色免洗淋巴細(xì)胞亞群分析方法進(jìn)行操作，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)分析測(cè)量結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間比較則采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1對(duì)比兩組CD4+T細(xì)胞各亞群水平

研究組患兒外周血Treg占CD4+T細(xì)胞的比率明顯高于對(duì)照組(t=4.01，P=0.04)。Th1占CD4+T細(xì)胞的比率在兩組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究組Th2占CD4+T細(xì)胞的比率明顯高于對(duì)照組(t=5.32，P=0.03)；研究組Th17占CD4+T細(xì)胞的比率明顯高于對(duì)照組(t=6.94，P=0.01),見表1。

2.2兩組淋巴細(xì)胞亞群所占百分率比較

研究組CD3+所占百分率明顯低于對(duì)照組(t=4.56，P<0.05)；研究組CD4+所占百分率的水平均明顯低于對(duì)照組(t=5.61，P<0.05)；研究組CD8+所占百分率明顯低于對(duì)照組(t=5.04，P<0.05)；研究組CD16+56+的水平均明顯低于對(duì)照組(t=6.77，P<0.05)，見表2。

Table 1 Comparison of percentage of peripheral blood Treg ,Th1, Th2 and Th17 cells between two ±S)

Table 2 Comparison of percentage of lymphocyte subsetsbetween two groups ±S)

2.3兩組血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較

兩組間白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，研究組淋巴細(xì)胞百分比較正常對(duì)照組低(t=7.99，P<0.05)；嗜酸性粒細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組(t=12.58，P<0.05)；單核細(xì)胞百分比水平均明顯高于對(duì)照組(t=12.06，P<0.05)，見表3。

表3　兩組血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較±S)

3討論

3.1哮喘相關(guān)流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)是一種分析單個(gè)微粒(如細(xì)胞，微生物和人工合成微球等)物理和化學(xué)特性的技術(shù)，其特點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、客觀、能定量。流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)的作用機(jī)理：懸浮在血液中的離散細(xì)胞單個(gè)地有順序的通過檢測(cè)區(qū)域時(shí)會(huì)發(fā)出電信號(hào)，從而可迅速的對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)的測(cè)定(例如細(xì)胞的大小、粒度、表面積，核質(zhì)的比率，DNA、RNA、蛋白質(zhì)的含量，細(xì)胞的活性，細(xì)胞因子，酶的活性等)并進(jìn)行分析，從而并可從整個(gè)集體中選出目標(biāo)細(xì)胞亞群。

3.2CD4+T細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群在小兒哮喘中的臨床意義

CD8+是抑制性細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞亞群，CD8+T細(xì)胞于殺死靶細(xì)胞后立即溶解，在發(fā)病時(shí)外周靜脈血中其含量不平穩(wěn)[6]。CD16+56+是自然殺傷細(xì)胞，它是機(jī)體的第一道防御屏障，可以清除病毒感染，降低了就表示患兒免疫力、清除病原的能力下降，這樣就會(huì)導(dǎo)致病程較延以及容易發(fā)生重復(fù)感染[7]。本研究結(jié)果試驗(yàn)組患兒CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+均低于對(duì)照組，提示哮喘患兒淋巴細(xì)胞抑制作用明顯降低，導(dǎo)致了其免疫力的抑制[8]。研究組Th17水平明顯高于對(duì)照組，這可能與Th17細(xì)胞應(yīng)答和氣道中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)對(duì)過敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性起主導(dǎo)作用有關(guān)。從本研究認(rèn)識(shí)到，哮喘患兒存在的免疫學(xué)改變，表現(xiàn)為Th2、Th17的水平明顯高于對(duì)照組，CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+百分率明顯低于對(duì)照組。這些研究結(jié)果提示了對(duì)哮喘患兒，在臨床治療中除了止咳、平喘對(duì)癥治療并抗感染外，還應(yīng)該注意加強(qiáng)其免疫功能的治療。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：侯偉]

Clinical significance of CD4+T cells and lymphocyte subsets in children with asthma

WU Bai-ping, ZHANG Yong-gang

(Pediatrics Department, Guangrao County TCM Hospital, Shandong Dongying 257300, China)

2015-10-09

吳百平(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事兒科臨床醫(yī)療工作。

張永剛，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.01.036

R725.6

A

1673-5293(2016)01-0104-03