崔艷偉，李文龍，常文鎖，李喜煥，張彩英

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室，河北　保定　071001）

黃烷酮3-羥化酶基因表達分析及轉(zhuǎn)基因大豆新種質(zhì)創(chuàng)制

崔艷偉，李文龍，常文鎖，李喜煥*，張彩英*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室，河北保定071001）

黃烷酮3-羥化酶（F3H）是大豆異黃酮代謝途徑重要酶類。研究F3H在不同大豆品種中的表達差異，并應(yīng)用轉(zhuǎn)基因途徑創(chuàng)制新種質(zhì)是提高大豆異黃酮含量的重要途徑。以高異黃酮含量大豆品種中豆27和低異黃酮含量大豆品種楚秀為試材，采用qPCR技術(shù)，分析F3H在大豆不同發(fā)育時期、組織部位中的表達差異；并利用花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得轉(zhuǎn)F3H陽性植株。結(jié)果表明：F3H在2個大豆品種R1～R7期葉片中的表達模式不同，中豆27的F3H表達量在R1期最高，而后開始下降，R2～R5期維持較低水平，R6期略有上升，R7期又出現(xiàn)下降；楚秀F3H表達量在R1～R4期較低，R5期出現(xiàn)表達高峰，R6期開始下降。F3H在2個大豆品種R5～R8期籽粒中的表達模式基本相同，表達量均從R5期開始下降，且R6～R8期維持較低水平。基于此，構(gòu)建F3H RNAi反義載體，并利用花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)入不同大豆品種，獲得了5個轉(zhuǎn)基因新材料。

大豆；異黃酮含量；黃烷酮3-羥化酶；基因表達；RNAi

大豆異黃酮合成代謝過程由苯丙烷途徑和異黃酮合成途徑共同組成，主要存在于豆科植物［1～5］。苯丙氨酸和丙二酰輔酶A在苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、香豆酸輔酶A連接酶等多種酶的催化作用下，經(jīng)羥基化、甲氧基化和烷基化等過程形成不同類型的異黃酮化合物［6～9］。在這些異黃酮成分中，大豆甙元、染料木素、黃豆素為該代謝途徑主要分支產(chǎn)物，受到眾多學(xué)者重視，其中，染料木素的合成與黃酮及花青素合成具有共同的前體物質(zhì)——柚皮素。

柚皮素為另一重要次生代謝產(chǎn)物，既可在異黃酮合酶（IFS）催化下合成染料木素，又可在黃烷酮-3-羥化酶（F3H）催化下合成花青素，還可在黃酮合成酶（FNS）作用下生成黃酮。由此可見，通過降低或抑制F3H、FNS表達水平，理論上可達到提高染料木素合成能力的目的［10，11］。夏濤等［12］、馬君蘭等［13］提出由于柚皮素參與多個代謝途徑，因而通過阻斷或降低其它途徑合成，可能提高大豆異黃酮含量。為分析上述途徑是否可行，少數(shù)學(xué)者進行了嘗試。Liu等［14］將大豆IFS轉(zhuǎn)入擬南芥F3H缺失體，由于分支途徑被阻斷，轉(zhuǎn)基因植株染料木素含量提高了5～30倍。Yu等［15］利用玉米C1和R轉(zhuǎn)錄因子，抑制F3H表達以阻斷花青素合成途徑，使大豆籽粒異黃酮含量升高。因此，進一步探討通過抑制分支途徑來提高異黃酮含量的可行性，對于選育高異黃酮大豆至關(guān)重要。

作者前期對213個黃淮海地區(qū)大豆的異黃酮含量進行分析，并從中篩選出了高異黃酮含量大豆品種中豆27和低異黃酮含量品種楚秀［16］。以中豆27和楚秀為試材，采用實時定量PCR技術(shù)分析F3H在2個品種不同發(fā)育時期及組織部位表達特性，明確F3H在高、低異黃酮含量大豆中的表達差異，并依此構(gòu)建F3H的RNAi載體轉(zhuǎn)化大豆，獲得轉(zhuǎn)基因植株，可為高異黃酮含量新品種培育提供基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為籽粒異黃酮含量差異較大的2個大豆品種，其中，中豆27為高異黃酮含量品種，楚秀為低異黃酮含量品種。

1.2試驗方法

1.2.1實時定量PCR分析取樣時期及部位2013年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心試驗場種植參試大豆品。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，行長2 m、行距0.5 m，2行/區(qū)，3次重復(fù)，田間管理方法同一般大田。

依據(jù)大豆生育期劃分標(biāo)準(zhǔn)［17］，分別于始花期（R1）、盛花期（R2）、始莢期（R3）、盛莢期（R4）、始粒期（R5）、鼓粒期（R6）、成熟初期（R7）和完熟期（R8），選擇相同植株部位的葉片或籽粒取樣，置塑封袋后立即進行液氮冷凍，-80℃超低溫冰箱保存，備用。

1.2.2大豆樣品cDNA合成與相關(guān)引物設(shè)計參照RNA simple Total RNA Kit操作指南，進行大豆葉片和籽粒總RNA提?。粎⒄誔rime ScriptRT reagent Kit With gDNA Eraser操作指南，進行cDNA合成。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到的黃烷酮3-羥化酶基因F3H序列（GenBank No.AY595420），設(shè)計實時定量PCR引物，同時以組成型表達基因Actin11為內(nèi)參設(shè)計引物（表1）。

表1　黃烷酮3-羥化酶基因相關(guān)引物及其序列Table 1　Primer sequences of Flavanone 3-hydroxylase gene

1.2.3F3H實時定量PCR分析采用SYBR GreenⅠ熒光染料法，參考Derveaux［18］方法進行。為保證供試基因?qū)崟r定量PCR結(jié)果可靠，試驗設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。實時定量PCR結(jié)果分析方法為：基因在不同品種葉片相對表達量=2-△△Ct，ΔΔCt=（Ct基因-CtActin11）品種1葉片-（Ct基因-CtActin11）品種2葉片；基因在不同品種籽粒相對表達量=2-△△Ct，ΔΔCt=（Ct基因-CtActin11）品種1籽粒-（Ct基因-CtActin11）品種2籽粒。

1.2.4F3H反義載體構(gòu)建設(shè)計引物F3H-F2和F3H-R2（表1），并在兩端引入SmaⅠ和PmlⅠ酶切位點序列，以高異黃酮大豆cDNA為模板進行擴增?；厥誔CR產(chǎn)物，并與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10，通過菌液PCR和酶切鑒定陽性克隆，并將陽性克隆進行測序，篩選序列正確的中間重組子。將中間重組子與植物表達載體pCambia3301分別采用SmaⅠ和PmlⅠ雙酶切，回收目的片段并進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10，菌液PCR與酶切鑒定篩選陽性克隆，并通過測序分析驗證序列正確性。

1.2.5F3H RNAi載體轉(zhuǎn)化大豆及陽性植株檢測利用大豆花粉管通道遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將構(gòu)建完成的F3H RNAi載體轉(zhuǎn)化不同大豆品種（東豆99-11、農(nóng)大豆2號等），并做好標(biāo)記。待豆莢成熟后收獲種子，然后播種于人工氣候室，利用50 mg/L除草劑篩選抗性植株，提取抗性植株DNA，經(jīng)PCR擴增與DNA測序，檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2　結(jié)果與分析

2.1F3H在不同大豆品種中的表達差異

利用高異黃酮大豆中豆27和低異黃酮大豆楚秀cDNA為模板，采用實時定量引物F3H-F1和F3H-R1分別進行PCR擴增，以檢測引物擴增結(jié)果準(zhǔn)確性，結(jié)果（圖1）顯示，能夠擴增出162 bp目的條帶，且擴增片段特異性高，沒有出現(xiàn)非特異條帶；進一步對擴增片段進行測序分析，發(fā)現(xiàn)其與NCBI注冊基因序列一致，證明上述引物擴增結(jié)果正確。

圖1　大豆F3H擴增片段瓊脂糖凝膠電泳檢測

在此基礎(chǔ)上，分析F3H在高、低異黃酮含量大豆葉片中的表達差異，結(jié)果（圖2）顯示，該基因在中豆27的R1期葉片表達量最高，而后表達量迅速下降，在R2～R5期保持較低水平（其中在R5期表達量最低），隨后在R6期出現(xiàn)第2個表達高峰，在R7期表達量又呈下降趨勢；在楚秀葉片中，F(xiàn)3H表達量在

圖2　F3H在不同大豆品種葉片中的表達差異Fig.2　Differential expression of F3H in different soybean varieties leaves

由此可見，由于F3H是大豆異黃酮合成過程中的一種底物競爭酶類，該基因的高效表達將會提高其競爭能力，不利于異黃酮合成與積累，故F3H在中豆27和楚秀中的表達量均較低，且由于該基因在中豆27的表達量更低，從而有利于中豆27異黃酮合成與R1～R4期較低，在R5期出現(xiàn)表達高峰，在R6～R7期表達量迅速下降。通過分析該基因在參試品種籽粒中的表達差異，發(fā)現(xiàn)F3H在2個品種籽粒中的表達趨勢基本相同，在R5～R8期均表現(xiàn)下降趨勢，沒有出現(xiàn)表達高峰（圖3）。積累。同時還發(fā)現(xiàn)，楚秀葉片R5期F3H表達量明顯高于其它時期，而中豆27葉片在R6期出現(xiàn)表達高峰，說明F3H參與底物競爭的關(guān)鍵時期發(fā)生在大豆發(fā)育的R5～R6期，且由于中豆27的該競爭反應(yīng)出現(xiàn)得時間較晚、競爭能力較小，而楚秀的該競爭反應(yīng)出現(xiàn)得時間較早、競爭能力相對較強，從而使中豆27異黃酮含量較高。因此，通過降低或抑制大豆品種的F3H表達，可實現(xiàn)提高異黃酮含量的目的。

圖3　F3H在不同大豆品種籽粒中的表達差異Fig.3　Differential expression of F3H in different soybean varieties seeds

2.2F3H RNAi載體構(gòu)建

利用引物F3H-F2和F3H-R2擴增F3H相應(yīng)序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，目的片段大小約為1 140 bp，與預(yù)期結(jié)果基本一致；回收該目的條帶，與T載體進行連接，形成中間重組子pMD-F3H，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR擴增獲得陽性克隆；將陽性克隆進行測序分析發(fā)現(xiàn)，與F3H相應(yīng)序列一致，可用于RNAi載體構(gòu)建。

利用核酸限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和PmlⅠ，分別酶切中間重組子pMD-F3H與植物表達載體pCambia3301，獲得酶切后的目的片段；回收目的片段，并進行連接、轉(zhuǎn)化以及菌液PCR擴增與酶切鑒定，獲得重組子pCambia3301-ASF3H（圖4）；將重組子進行測序分析發(fā)現(xiàn)序列正確無誤，表明RNAi載體pCambia3301-ASF3H構(gòu)建成功。

2.3F3H RNAi載體轉(zhuǎn)化大豆及轉(zhuǎn)基因材料獲得

圖4RNAi載體pCambia3301-ASF3H酶切產(chǎn)物的鑒定

利用花粉管通道轉(zhuǎn)化技術(shù)，將RNAi載體pCambia3301-ASF3H轉(zhuǎn)入不同大豆品種，收獲轉(zhuǎn)化后的T0種子，并播種于人工氣候室；出苗后，噴施除草劑初步篩選陽性植株，野生型對照由于不抗除草劑出現(xiàn)葉片失綠現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因抗性植株葉片顏色基本不變（圖5）。進一步提取抗性植株葉片DNA，進行目的基因PCR檢測，結(jié)果顯示，可以擴增出目的條帶；回收目的條帶測序證明其序列正確，說明RNAi載體pCambia3301-ASF3H已轉(zhuǎn)入大豆基因組（圖6）；將陽性植株自交，收獲種子，獲得了轉(zhuǎn)F3H的T1大豆新材料5個（表2）。

圖5　利用除草劑鑒定技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆葉片顏色變化Fig.5　Leaf colour identification results of transgenic soybean by herbicide

圖6轉(zhuǎn)基因陽性植株F3H測序結(jié)果

3　結(jié)論與討論

在大豆異黃酮合成途徑中涉及到的酶類有十幾種，目前一般采用2種策略來提高異黃酮含量［10］：第1種策略是通過分析該途徑的限速步驟，克隆或外源合成限速步驟相關(guān)酶類或基因，并導(dǎo)入細胞增強限速酶的表達量，打破關(guān)鍵步驟的合成瓶頸，進而提高異黃酮含量；第2種策略是通過分析異黃酮代謝途徑中的分支途徑，利用RNAi技術(shù)減少或阻塞非目標(biāo)代謝物的合成，從而減少分支代謝途徑的流向，為異黃酮合成提供更加充足的合成前體［19］。其中，第1種策略研究報道較多，但由于涉及的酶類或基因數(shù)量較多，故單一基因的超表達轉(zhuǎn)化研究進展不盡人意，目前有學(xué)者提出采用“多基因”轉(zhuǎn)化的思路來提高大豆異黃酮含量［20～22］。關(guān)于第2種提高異黃酮含量的策略，目前已有學(xué)者開始嘗試并取得部分研究進展，如，張艷等［23］通過構(gòu)建異黃酮代謝分支途徑F3H反義載體，抑制大豆花青素合成通路，以提高異黃酮合成能力；江曼等［24］將GhF3H RNAi載體轉(zhuǎn)入棉花，獲得了GhF3H表達水平顯著降低的棉花資源，證實通過抑制GhF3H表達水平可以改變棉花類黃酮合成；Liu等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥tt6/tt3突變體中，F(xiàn)3H表達受到抑制，導(dǎo)致該突變體異黃酮含量增加；柳青等［25］利用RNAi技術(shù)構(gòu)建F3H反義載體，得到了4株轉(zhuǎn)基因植株，其異黃酮含量均表現(xiàn)明顯增加。作者通過分析F3H在高、低異黃酮含量大豆品種中的表達差異，同樣發(fā)現(xiàn)，該基因高效表達不利于異黃酮合成與積累?；诖耍瑯?gòu)建了大豆F3H的RNAi載體，并將其轉(zhuǎn)入異黃酮含量低但豐產(chǎn)性好、抗病的大豆品種，獲得了轉(zhuǎn)基因T1材料，為高異黃酮含量轉(zhuǎn)基因大豆新品種培育提供了新的種質(zhì)資源。

表2 轉(zhuǎn)pCambia3301-ASF3H大豆新材料　（個）Table 2　Transgenic soybean germplasms with pCambia3301-ASF3H

利用高異黃酮含量大豆品種中豆27和低異黃酮含量大豆品種楚秀，分析F3H在不同大豆品種葉片和籽粒中的表達差異，證實該基因高水平表達不利于異黃酮積累。基于此，構(gòu)建F3H RNAi載體并轉(zhuǎn)入低異黃酮含量大豆，獲得了轉(zhuǎn)基因材料，為進一步選育高異黃酮含量大豆品種奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。Engineering，2009，11（6）：355-366.

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Expression Analysis of Flavanone 3-Hydroxylase Gene and Innovation of Transgenic Elite Germplasms in Soybean

CUI Yan-wei，LI Wen-long，CHANG Wen-suo，LI Xi-huan*，ZHANG Cai-ying*
（North China Key Laboratory of Crop Germplasm Resources of Education Ministry of China，Agriculture University of Hebei，Baoding 071001，China）

Flavanone 3-hydroxylase（F3H）is an important enzyme involved in the metabolism pathway of soybean isoflavones.Analysis of the expression pattern of F3H in different soybean varieties and cultivation of the transgenic germplasms with F3H are important methods to enhance the isoflavone of soybean.In this study，the expression patterns of F3H at different developmental stages and organs in both high isoflavone content soybean variety Zhongdou 27 and low isoflavone content germplasm Chuxiu were analyzed by qPCR and transgenic elite germplasms with RNA interference vector of F3H were obtained.The results indicated that F3H showed quite different expression patterns between the two soybean varieties in the leaf.The expression level of F3H in Zhongdou 27 began falling at the R1 stage，maintained lower expression level at R2-R5 stage，increased a little bit at R6 stage and got down again at R7 stage.While in the leaf of Chuxiu，F(xiàn)3H showed lower expression level at R1-R4 stages，highest level at R5 stage and falling expression level at R6 stage.The expression patternsofF3Hwerealmostthesameinthe seeds of these two soybean varieties，beginning falling at stage R5 and maintaining the lower level at stages R6-R8.Based on these results，the RNA interference vector of F3H was constructed and introduced into soybean varieties through the pollentube pathway transgenic technology，and five transgenic elite germplasms were obtained by now.

Soybean；Isoflavonescontent；Flavanone 3-hydroxylase；Geneexpression；RNAinterference

S565.1

A

1008-1631（2016）02-0062-05

2015-08-11

河北省自然科學(xué)基金項目（C2013204020）

崔艷偉（1987-），女，河北衡水人，碩士，主要從事大豆分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因研究。E-mail：cuiyanwei07@126. com。

李喜煥（1974-），女，河北保定人，副教授，博士，主要從事大豆遺傳育種與轉(zhuǎn)基因研究。Tel：0312-7528122；E-mail：lixihuan@hebau.edu.cn。

通訊作者：張彩英（1960-），女，河北深澤人，研究員，博士，主要從事大豆遺傳育種與轉(zhuǎn)基因研究。電話：0312-7521558；E-mail：zhangcaiying@hebau.edu.cn。