于妮娜，張　玲，孟淑華

(1.陜西省新藥審評中心，西安　710065；2.西安天一秦昆制藥有限責(zé)任公司，西安　710077)

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阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析法

于妮娜1，張玲2，孟淑華2

(1.陜西省新藥審評中心，西安710065；2.西安天一秦昆制藥有限責(zé)任公司，西安710077)

目的 建立阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)的測定方法。方法采用反相HPLC法，測定阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)的含量。采用SyncronisC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相A為醋酸緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃(61∶27∶12)，流動相B為醋酸緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃(47∶41∶12)；流速為1.5mL·min-1；檢測波長為260nm；柱溫為35 ℃。結(jié)果阿托伐他汀鈣雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4、雜質(zhì)6與阿托伐他汀峰均可達(dá)到基線分離；檢測限分別為阿托伐他汀2ng，雜質(zhì)1 2ng、雜質(zhì)2 2ng、雜質(zhì)3 2ng、雜質(zhì)4 2ng、雜質(zhì)6 1.6ng，且重復(fù)性良好，總雜質(zhì)RSD值為1.87%(n=6)。結(jié)論該方法穩(wěn)定、可靠、專屬性強(qiáng)，可用于阿托伐他汀鈣片的有關(guān)物質(zhì)檢測。

阿托伐他汀鈣；有關(guān)物質(zhì)；雜質(zhì)測定；高效液相色譜法

阿托伐他汀鈣(C33H34FN2O5)2Ca·3H2O是選擇性、競爭性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，可顯著降低膽固醇水平，降低心肌梗死和腦卒中的發(fā)病危險，對原發(fā)性高膽固醇血癥，包括家族性高膽固醇血癥、混合型高膽固醇血癥以及純合子家族性高膽固醇血癥患者具有顯著的療效。對于阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)的研究也有文獻(xiàn)報道[1-4]，而國家標(biāo)準(zhǔn)[5-6]僅控制單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)，對于雜質(zhì)的研究并不充分，不能有效地控制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合USP、CP和EP等[7-8]對阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)的檢測方法進(jìn)行研究，采用對照品外標(biāo)法對已知雜質(zhì)進(jìn)行定性、定量測定，其他未知雜質(zhì)采用主成分自身對照法定量。本實(shí)驗(yàn)所建立方法可使阿托伐他汀鈣、5個已知雜質(zhì)及未知雜質(zhì)達(dá)到基線分離，且方法簡便易行、結(jié)果準(zhǔn)確。

1　儀器與試藥

1.1儀器U3000型高效液相色譜儀(美國戴安ThermoSeparationProducts公司)；BS110S型分析天平，CP225D型分析天平(德國賽多利斯公司)；色譜柱：SyncronisC18(250mm×4.6mm，Thermo公司)；C18柱(250mm×4.6mm，粒徑5μm，江蘇漢邦公司)；XB-C18柱(250mm×4.6mm，粒徑5μm，Welchmaterials公司)。

1.2試藥色譜純：乙腈，四氫呋喃(TEDIA公司)；冰醋酸(江蘇漢邦公司)。分析純：檸檬酸，氨水(天津市登峰化學(xué)試劑廠)；醋酸銨(鄭州派尼化學(xué)試劑廠)。水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。流動相A:醋酸緩沖液(取醋酸銨3.9g，加水1 000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.0～5.1)∶乙腈∶四氫呋喃(61∶27∶12)；流動相B:醋酸緩沖液∶乙腈∶四氫呋喃(47∶41∶12)；按照下列程序梯度洗脫[9],見表1，進(jìn)樣前平衡10min。流速：1.5mL·min-1；檢測波長：260nm；柱溫：35 ℃。

2.2系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)取阿托伐他汀鈣及阿托伐他汀雜質(zhì)2對照品適量，加混合溶劑[以0.05mol·L-1的檸檬酸銨溶液(0.05mol·L-1檸檬酸用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.4)-乙腈(50∶50)]制成質(zhì)量濃度為50μg·mL-1的溶液，取20μL注入液相色譜儀，理論板數(shù)以阿托伐他汀計(jì)應(yīng)不低于5 000，分離度應(yīng)符合要求。見圖1。

表1梯度洗脫順序

Tab.1Thegradientelutionprogram

時間/min流動相A/%流動相B/%01000401000650100850100

圖1系統(tǒng)適用性色譜圖

1.雜質(zhì)2；2.阿托伐他汀鈣

Fig.1Systemsuitabilitychromatograms

1.impurity2；2.atorvastatincalcium

2.3專屬性為了考證色譜系統(tǒng)是否適用于本品各種降解產(chǎn)物的分離，采用酸、堿、光照、氧化和加熱方法對樣品溶液進(jìn)行破壞實(shí)驗(yàn)，使其產(chǎn)生降解產(chǎn)物的峰，在HPLC條件下檢測雜質(zhì)峰與主峰分離的情況。(1)酸破壞實(shí)驗(yàn)：取本品細(xì)粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入混合溶劑10mL使其溶解，再加入1mol·L-1的鹽酸溶液1.0mL，放置24h，用1mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)至中性；(2)堿破壞實(shí)驗(yàn)：取本品細(xì)粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入混合溶劑10mL溶解，再加入1.0mL1mol·L-1的氫氧化鈉溶液，放置24h，用1mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)至中性；(3)氧化破壞：取本品細(xì)粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入混合溶劑10mL溶解，再加入0.1mL的雙氧水(濃度為30mL·L-1)，放置12h，加溶劑定容至刻度；(4)光破壞實(shí)驗(yàn)：取本品細(xì)粉0.15g，置于20mL量瓶中，加入溶劑溶解并定容至刻度，在4 500±500lx的光照箱中放置24h；(5)熱破壞實(shí)驗(yàn)：取本品細(xì)粉0.15g，置于20mL量瓶中，加溶劑溶解并定容至刻度，置于干燥箱中70 ℃放置24h，取出，放至室溫。取上述破壞實(shí)驗(yàn)溶液，按照2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測，色譜見圖2～3。結(jié)果顯示，主成分峰與酸、堿、光、熱和氧化破壞產(chǎn)生的降解物均可達(dá)到有效分離，說明該色譜條件可有效分離雜質(zhì)，且輔料對測定不產(chǎn)生干擾[10]。

圖2 破壞性實(shí)驗(yàn)色譜圖

a.供試品；b.光照破壞；c.高溫破壞；d.堿破壞；e.酸破壞；f.氧化破壞

Fig.2Destructivetestchromatograms

a.testsampleb.destroyedbylight；c.destroyedbyheat；d.destroyedbyalkali；e.destroyedbyacid；f.destroyedbyoxidative

2.4線性及范圍分別取阿托伐他汀鈣對照品及阿托伐他汀鈣雜質(zhì)1，2，3，4和6對照品適量，按照對照品溶液的制備方法配制成1mL約含阿托伐他汀及阿托伐他汀鈣雜質(zhì)(1，2，3，4 和6) 0.3，0.6，1.2，1.8，2.4和3.0μg的混合溶液(阿托伐他汀鈣雜質(zhì)1，2和3以游離形式即去氟阿托伐他汀、反式阿托伐他汀和雙氟阿托伐他汀計(jì)算)，分別精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積積分值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，對測定結(jié)果進(jìn)行回歸分析，雜質(zhì)1，2，3，4和6的回歸方程如下：Y=0.411 2 X-0.001 1，r=0.999 8；Y=0.383 4 X+0.002 8，r=0.999 8；Y=0.390 2 X-0.005 6，r=0.999 8；Y=0.313 7 X-0.008 8，r=0.999 8；Y=0.405 X+0.004 6，r=0.999 8。

結(jié)果表明，阿托伐他汀鈣雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4和雜質(zhì)6的進(jìn)樣量分別在6.182～74.184ng，5.802～69.624ng，6.196～74.352ng，6.0～72.0ng和6.4～64.0ng之間時，各雜質(zhì)的進(jìn)樣量與峰面積積分值之間呈良好的線性關(guān)系。

圖3HPLC圖

A.空白；B.混合對照品；C.供試品；1.雜質(zhì)1；2.雜質(zhì)2；3.阿托伐他汀鈣；4.雜質(zhì)3；5.雜質(zhì)4；6.雜質(zhì)6

Fig.3HPLCchromatograms

A.blank；B.mixedreferencesubstance；C.testsamples；1.impurity1；2.impurity2；3.atorvastatincalcium；4.impurity3；5.impurity4；6.impurity6

2.5檢測限精密量取混合阿托伐他汀及各雜質(zhì)的混合對照品，用混合溶劑乙腈-水(50∶50)逐步稀釋至各主峰的響應(yīng)值約為噪音水平的3倍時，記錄色譜圖，得出各檢測限分別約為：阿托伐他汀2ng，雜質(zhì)1 2ng、雜質(zhì)2 2ng、雜質(zhì)3 2ng、雜質(zhì)4 2ng、雜質(zhì)6 1.6ng。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液6份，吸取20μL，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，記錄色譜圖和數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除總雜質(zhì)的RSD值為1.87%，其他已知單個雜質(zhì)測定結(jié)果無差異，重復(fù)性良好，誤差在允許的范圍內(nèi)。

2.7溶液穩(wěn)定性取供試品溶液和自身對照溶液，分別在0，4，8，26和30h取樣20μL，注入液相色譜儀(暗處放置)，記錄色譜圖及峰面積積分值，結(jié)果表明，樣品溶液中主成分及雜質(zhì)峰面積在8h內(nèi)穩(wěn)定，有關(guān)物質(zhì)個數(shù)及量不變，8h后雜質(zhì)4和雜質(zhì)6及氧化主雜質(zhì)變化顯著，因此本品有關(guān)物質(zhì)測定供試品溶液應(yīng)現(xiàn)制，放置不得超過8h。

2.8樣品測定按照建立的方法測定10批樣品，結(jié)果見表2。

表210批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果(外標(biāo)法測定)

Tab.2 10batchesofsamplesrelatedsubstancesdeterminationresults(externalstandardmethod)

批號有關(guān)物質(zhì)/%雜質(zhì)1雜質(zhì)2雜質(zhì)3雜質(zhì)4雜質(zhì)6(主峰)1011010.110.100.040.440.201011020.120.120.040.210.161011030.120.090.040.290.181012010.120.130.060.130.091012020.150.140.050.200.161012030.120.130.040.230.131012040.140.090.030.260.131101010.130.090.030.080.081101020.110.090.020.100.101101030.110.080.050.050.03

3　討論

3.1流動相的選擇與分析原料標(biāo)準(zhǔn)[YBH00262010]有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫,隨著四氫呋喃增加基線逐漸明顯向上漂移嚴(yán)重，采用扣除基線的方法測定，但色譜峰仍難以辨識且積分不準(zhǔn)確，四氫呋喃用量較大、價格昂貴、氣味毒性較大。標(biāo)準(zhǔn)[H20030118]方法阿托伐他汀雜質(zhì)在前40 min分離較好，各個雜質(zhì)基本達(dá)到基線分離，但在75 min后雜質(zhì)仍不能完全洗脫出柱。歐洲藥典和美國藥典方法阿托伐他汀雜質(zhì)在70 min分離較好，各個雜質(zhì)基本達(dá)到基線分離，75 min雜質(zhì)基本洗脫出柱，但70 min以后基線不平，仍有饅頭峰出現(xiàn)。經(jīng)參考?xì)W洲藥典和美國藥典方法調(diào)整流動相，A相微調(diào)，保證阿托伐他汀保留時間在27～34 min之間，運(yùn)行40 min；調(diào)整B相乙腈的比例及梯度時間，確定最終流動相。在調(diào)節(jié)流動相的過程中，增加乙腈比例和pH值，可使阿托伐他汀保留時間縮短，反之亦然。

在此色譜條件下，阿托伐他汀保留時間在27～34min之間，已知阿托伐他汀鈣雜質(zhì)1，2，3，4和6均能達(dá)到基線分離，雜質(zhì)2與阿托伐他汀分離度≥1.5，其他雜質(zhì)峰也基本能達(dá)到基線分離，雜質(zhì)在80min能完全被洗脫出柱，基線平穩(wěn)，繼續(xù)洗脫至120min無雜質(zhì)峰出現(xiàn)。

3.2檢測波長的選擇將阿托伐他汀鈣及阿托伐他汀雜質(zhì)1，2，3，4和6對照品溶液及空白輔料溶液在200～400nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，在244和260nm處各溶液所出峰的個數(shù)相同，各個峰在260nm下的峰面積約為244nm下的80%～90%。260nm下梯度運(yùn)行基線比244nm下平穩(wěn)，更利于色譜峰的積分和判斷。

3.3色譜柱及pH值的影響本品有關(guān)物質(zhì)多，因此對色譜柱的要求較高，在已對比使用的色譜柱中以Thermo公司的SyncronisC18(250mm×4.6mm)，(填料參數(shù)：碳載量16%，粒徑5μm，孔徑100A，比表面積320m2·g-1，USP分類為L1)分離效果最好。本色譜系統(tǒng)乙腈和pH值對主峰的保留時間影響較大，增加乙腈和升高pH值均會使主峰保留時間縮短，反之亦然。實(shí)驗(yàn)以精密pH值計(jì)調(diào)節(jié)pH值在5.0±0.1范圍內(nèi)，必要時調(diào)節(jié)乙腈比例使阿托伐他汀保留時間在26～34min之間，相對保留時間變化不明顯。

[1]張亞平，楊淑蓮，陳芬兒.HPLC法檢測阿托伐他汀鈣有關(guān)物質(zhì)的含量及光學(xué)純度[J].藥物分析雜志，2010，30(12)：2311-2313.

[2]李文莉，鐘慶元，文慶.HPLC法測定阿托伐他汀鈣膠囊的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2007，27(2):267-269.

[3]王艷麗，于曉原，張璐璐，等.阿托伐他汀鈣治療老年冠心病合并高脂血癥的療效觀察[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(6):630-631.

[4]汪欽標(biāo)，楊成鈺.HPLC法測定阿托伐他汀鈉含量及有關(guān)物質(zhì)[J].輕工科技，2012，(3)：124-125.

[5]蔣廈，沈衛(wèi)陽.RP-HPLC法測定阿托伐他汀鈣片的有關(guān)物質(zhì)[J].海峽藥學(xué)，2013，25(8):60-62.

[6]WS1-(X-106)-2003Z，國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[S].

[7]YBH00262010，國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[S].

[8]USP34-29NF29 [S].2011：1949.

[9]EP7.1[S].2011：3380.

[10]王嫦鶴，焦艷，杜珊，等．HPLC法測定烏拉地爾不同制劑中的有關(guān)物質(zhì)[J] 西北藥學(xué)雜志，2013，28(3): 254-257.

Determination of the related substances in Atorvastatin Calcium Tablets by HPLC

YU Nina1，ZHANG Ling2，MENG Shuhua2

(1.ShaanxiProvincialCenterforNewDrugEvaluation，Xi′an710065，China；2Xi′anTianyiqinkunPharmaceuticalLimitedCompany，Xi′an710077，China)

ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationoftherelatedsubstancesinAtorvastatinCalciumTablets.MethodsRP-HPLCwasadoptedtodeterminethecontentofatorvastatincalcium.ThedeterminationwasperformedonaSyncronisC18column(250mm×4.6mm，5μm)withthemobilephaseAconsisitedofacetatebuffer-acetonitrile-tetrahydrofuran(61∶27∶12)，andthemobilephaseBconsisitedofacetatebuffer-acetonitrile-tetrahydrofuran(47∶41∶12).Theflowratewas1.5mL·min-1，andthedetectivewavelengthwassetat260nm.Thecolumntemperaturewas35 ℃.ResultsTheimpurities1，2，3，4，6andatorvastatincalciumpeakswerebaselinelyseparated.Thelimitofdetectionofatorvastatinwas2ng，andthelimitsofimpurities1，2，3，4and6were2，2，2，2and1.6ng.Therepeatbilityperformedwell，andtheRSDwas1.87%(n=6).ConclusionThemethodisreliable，stable，andspecific，anditissuitableforthethedeterminationoftherelatedsubstancesinAtorvastatinCalciumTablets.

atorvastatincalcium；relatedsubstances；determinationofimpurities；HPLC

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.008

R917

A

1004-2407(2016)05-0466-04

2015-12-01)