龐新莉，郭歡迎，李峰麗

(1.西安市兒童醫(yī)院，西安　710083；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安　710065；3.北京康遠(yuǎn)制藥有限公司，北京　100071)

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青莢葉指紋圖譜的研究

龐新莉1，郭歡迎2，李峰麗3

(1.西安市兒童醫(yī)院，西安710083；2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安710065；3.北京康遠(yuǎn)制藥有限公司，北京100071)

目的 建立青莢葉的高效液相(HPLC)指紋圖譜，為其制藥、采收、利用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法以木犀草素為對(duì)照品，采用反相高效液相色譜法測定10批不同商家的青莢葉，繪制色譜圖，確立參照指紋圖譜，并用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，計(jì)算其相似度。色譜條件：色譜柱：ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：350 nm；記錄時(shí)間：30 min。結(jié)果共標(biāo)示出青莢葉的5個(gè)特征指紋峰；各批樣品相似度介于0.80～0.99之間。表明不同批次的青莢葉組成相似，但含量稍有差異。結(jié)論所建立的青莢葉HPLC指紋圖譜測定方法穩(wěn)定性及重復(fù)性較好，為青莢葉的應(yīng)用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

青莢葉；反相高效液相色譜法；指紋圖譜

青莢葉Helwingiajaponica(Thunb)來源于山茱萸科青莢葉屬，又名葉上花、葉上果等，其莖、葉、根都可入藥[1]。青莢葉中含有表兒茶素、β-胡蘿卜苷、棕櫚酸、甘油酯、桂皮酸、木犀草素和7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等成分[2-3]。指紋圖譜是一種順應(yīng)中藥中組分多、靶點(diǎn)多、從“全成分”的角度出發(fā)的現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制方法，能夠全面評(píng)價(jià)中藥的化學(xué)成分[4]，反映中藥材的質(zhì)量，在中藥材及制劑質(zhì)量控制領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[5-6]。國內(nèi)外現(xiàn)有文獻(xiàn)中僅對(duì)青莢葉的含量測定有報(bào)道，而對(duì)青莢葉指紋圖譜研究的論文未見報(bào)道。為了能更全面地控制青莢葉的質(zhì)量，本文選擇木犀草素作為對(duì)照品，利用HPLC法建立了10批青莢葉藥材的指紋圖譜，以木犀草素為對(duì)照品特征峰，建立青莢葉的指紋圖譜測定方法，為青莢葉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1220高效液相色譜儀(安捷倫科技公司)，配置：Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，手動(dòng)進(jìn)樣器，真空在線脫氣，VWD紫外檢測器，恒溫柱溫箱；SENCOR系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；SXKW數(shù)顯控溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(上海予申儀器有限公司)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SQP124型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥甲醇、乙醚、磷酸均為分析純；甲醇為色譜純；娃哈哈純凈水；木犀草素對(duì)照品(上海金穗生物科技有限公司，JS90108-20mg)；10批青莢葉藥材分別在不同時(shí)間、不同商家購買于陜西省中藥材批發(fā)市場，經(jīng)鑒定為山茱萸科青莢葉。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱: Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相是甲醇-2 mL·L-1磷酸溶液(75∶25)，等度洗脫；流速：1.0 mL·min- 1；檢測波長：350 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2制備對(duì)照品溶液精密稱取木犀草素對(duì)照品8.5 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容(1 mL甲醇溶液中含0.34 mg木犀草素)，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，備用。

2.3制備青莢葉樣品溶液取青莢葉，干燥粉碎后，過20目篩，精密稱取3.0 g，加30 mL甲醇在80 ℃水浴中加熱回流2次，每次2 h，過濾后合并濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，用乙醚萃取3次，每次乙醚的用量為30 mL。將3次乙醚萃取液合并后水浴蒸干[7]，用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，即為供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積值(Y)對(duì)木犀草素進(jìn)樣量 (X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 975.6X-2 211.6(r=0.999 8)。結(jié)果表明，木犀草素進(jìn)樣量在0.34～6.8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2木犀草素含量測定按照2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)10個(gè)批次的青莢葉樣品進(jìn)行含量測定，并根據(jù)回歸方程計(jì)算出木犀草素在青莢葉樣品中的含量，結(jié)果S1～S10中木犀草素的含量分別為0.15%,0.12%,0.13%,0.14%,0.13%,0.15%,0.14%,0.12%,0.14%和0.14%。2.4.3精密度實(shí)驗(yàn)稱取青莢葉藥材粉末(S1)，按照2.3項(xiàng)下方法制備青莢葉樣品溶液，在同一天連續(xù)進(jìn)樣5次，測出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和保留峰面積，計(jì)算出RSD值分別為1.0%～2.4%和0.82%～2.7%。RSD值均小于5%，達(dá)到指紋圖譜對(duì)色譜條件的技術(shù)要求。2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)稱取青莢葉藥材粉末(S1)，按照2.3項(xiàng)下方法制備青莢葉樣品溶液，分別在0，4，8，12，16，20和24 h進(jìn)行取樣檢測，測出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和保留峰面積，計(jì)算出RSD值分別為1.1%～1.9%和1.3%～2.7%。RSD值均小于5%，表明青莢葉樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，達(dá)到指紋圖譜對(duì)色譜條件的技術(shù)要求。

2.4.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取青莢葉藥材粉末(S1)， 按照2.3項(xiàng)下方法制備青莢葉樣品溶液，進(jìn)行取樣檢測，測出各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和保留峰面積的RSD值分別為0.8%～1.6%和1.3%～2.8%，表明此方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜對(duì)色譜條件的技術(shù)要求。

2.4.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)稱取已知含量的青莢葉粉末6份(S1)，加入1 mL對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法制備青莢葉樣品溶液后按照選定的色譜條件進(jìn)行測定。測出木犀草素的加樣回收率范圍為99.85%～100.5%， RSD值為0.10%，結(jié)果見表1。

表1木犀草素加樣回收率實(shí)驗(yàn)

Tab.1 The results of luteolin recovery test

樣品號(hào)取樣量/mL供試品含量/μg加入量/μg測得總含量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.517.04340357.24100.1099.950.1020.517.04340357.13100.0030.517.04340357.0099.9940.517.04340356.8799.9550.517.04340356.4599.8360.517.04340356.5699.85

2.5青莢葉指紋圖譜分析與評(píng)價(jià)

2.5.1青莢葉指紋圖譜分析方法的建立及共有峰的標(biāo)定取青莢葉藥材粉末，按照2.3項(xiàng)下方法制備青莢葉樣品溶液，將木犀草素對(duì)照品和10個(gè)青莢葉樣品溶液按照選定的色譜條件分別進(jìn)樣測定分析，得到青莢葉樣品對(duì)照HPLC色譜圖，見圖1A[8]。經(jīng)木犀草素對(duì)照品定性，鑒定出2號(hào)色譜峰為木犀草素，見圖1B。2.5.2木犀草素對(duì)照?qǐng)D譜利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) (2004 版A)對(duì)不同的10批青莢葉藥材中木犀草素HPLC圖譜進(jìn)行處理，選擇青莢葉色譜圖中的5個(gè)共有峰作為校正點(diǎn)，建立青莢葉藥材的對(duì)照指紋圖譜，見圖2。由圖1B可知，木犀草素的色譜峰出峰時(shí)無拖尾，分離度較好，峰面積值所占比例較大且出峰保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，因此選擇木犀草素色譜峰為參照峰，計(jì)算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值，結(jié)果見表2～3。

圖1HPLC圖

A.10 批青莢葉樣品；B.木犀草素對(duì)照品；2.木犀草素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.10 batchesHelwingiajaponicasamples；B.reference substances；2.luteolin

表210批青莢葉藥材指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

Tab.2 The 10 batches ofHelwingiajaponicafingerprint of the relative retention time of common peaks

編號(hào)峰1峰2峰3峰4峰5S10.820.991.121.891.35S20.800.981.131.901.36S30.830.971.101.871.40S40.780.101.141.901.39S50.770.121.091.911.31S60.820.971.121.881.36S70.840.961.081.861.32S80.790.991.101.931.41S90.800.131.131.901.38S100.780.111.091.871.34

圖210批青莢葉藥材對(duì)照指紋圖譜共有模式

Fig.2 10 batchesHelwingiajaponicaherbs fingerprints of the control model

2.5.31青莢葉指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版A)，使用中位數(shù)

法對(duì)所得的10批青莢葉藥材的HPLC 指紋圖譜全譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果顯示，10批青莢葉藥材的HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相比，相似度分別為：0.922，0.943，0.997，0.978，0.957，0.962，0.947，0.982，0.963和0.919。充分證明，10批青莢葉藥材與對(duì)照峰R的相似度較大，差異不顯著，因此所選擇的5個(gè)共有峰可以作為青莢葉藥材指紋圖譜的特征峰進(jìn)行青莢葉藥材的鑒別，相似度結(jié)果見表4。

表310批青莢葉藥材指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

Tab.3 The 10 batches ofHelwingiajaponicafingerprints of common peaks

編號(hào)峰1峰2峰3峰4峰5S10.141.000.0900.154.47S20.160.990.1000.164.48S30.130.970.0930.144.43S40.101.020.0970.184.46S50.151.030.1100.154.42S60.170.950.0960.174.48S70.140.960.0920.134.46S80.160.970.0910.174.49S90.170.970.1000.144.48S100.150.980.0950.184.43

3　結(jié)論與討論

3.1流動(dòng)相的選擇本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液，以比例58∶42，60∶40和65∶35作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，但由于樣品未能很好地分離且峰形有前沿現(xiàn)象。最后采用甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液(75∶25)為流動(dòng)相，木犀草素出峰保留時(shí)間適中(20 min)，峰形較為理想，分離度好。

表4青莢葉藥材相似度結(jié)果

Tab.4 The similarity results ofHelwingiajaponicaherbs

編號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對(duì)照指紋圖譜S11.0000.9640.9210.8970.8460.9930.8620.9970.7990.8790.922S20.9641.0000.8740.8690.8540.9780.7990.9870.9720.9990.943S30.9210.8741.0000.9480.9340.8570.8220.8990.8510.8340.997S40.8970.8690.9481.0000.9760.8230.8670.8800.9000.8890.978S50.8460.8540.9340.9761.0000.9540.8990.9070.9520.9670.957S60.9930.9780.8570.8230.9541.0000.9230.9690.8990.8790.962S70.8620.7990.8220.8670.8990.9231.0000.8590.8810.8740.947S80.9970.9870.8990.8800.9070.9690.8591.0000.9510.9340.982S90.7990.9720.8510.9000.9520.8990.8810.9511.0000.9590.963S100.8790.9990.9340.8890.9670.8790.8740.9340.9591.0000.919對(duì)照指紋圖譜0.9220.9430.9970.9780.9570.9620.9470.9820.9630.9191.000

3.2樣品前處理優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)供試品前處理方法采用甲醇加熱回流2次，合并濾液，最后定容至100 mL量瓶中，作為儲(chǔ)備液備用。但在進(jìn)行HPLC分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)供試品進(jìn)樣后出峰效果不好，分離度差，所需的主峰有拖尾現(xiàn)象，最后采用乙醚對(duì)供試品精制萃取3次后，發(fā)現(xiàn)供試品出峰效果好，分離度高，所需主峰峰形完整。

3.3青莢葉藥材指紋圖譜評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)對(duì)10批青莢葉藥材進(jìn)行了HPLC色譜分析，選擇了穩(wěn)定性較好、紫外吸收較強(qiáng)的5個(gè)色譜峰作為共有峰。結(jié)果顯示,10批青莢葉藥材相似度數(shù)值均大于0.919，證明這10批藥材的液相圖譜差異不顯著，因此所選擇的5個(gè)共有峰可以作為青莢葉藥材指紋圖譜的特征峰進(jìn)行青莢葉藥材的鑒別。

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HPLC fingerprint of Helwingia japonica

PANG Xinli1，GUO Huanying2，LI Fengli3

(1.Children′s Hospital of Xi′an，Xi′an 710083，China；2.Shaanxi Provincial Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710065，China；3.Beijing Kangyuan Pharmaceutical Limited Company，Beijing 100071，China)

Objective To establish HPLC fingerprint ofHelwingiajaponicaand to provide a reference for harvest，application and quality evaluation ofHelwingiajaponica.Methods RP-HPLC method was used to determine the content of 10 batchesHelwingiajaponicafrom different habitats with rutin and quercetin as control.The similarity was calculated using fingerprint similarity evaluation system.The separation was performed on a Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column with mobile phase consisted of methanol-2 mL·L-1phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1lasting for 30 min.The UV detection wavelength was set at 350 nm and column temperature was at 25 ℃.Results The results showed that 5 peaks were recognized as common peaks.The similarity index of 10 batchesHelwingiajaponicasamples were between 0.80～0.99.The results indicated the chemical components were similar but the contents of the compounds was different.Conclusion The established HPLC fingerprint ofHelwingiajaponicais stable，reliable and reproducible，which is valuable for harvest，application and quality evaluation ofHelwingiajaponica.

Helwingiajaponica；RP-HPLC；fingerprint

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81202492)

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.002

R284

A

1004-2407(2016)05-0444-05

2016-03-10)