蔡　艷，宋　劍，王貴金，賈繼明

(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，石家莊　050035)

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·中藥及天然藥物·

UPLC法測(cè)定人參總皂苷提取物中7種人參皂苷的含量

蔡艷，宋劍，王貴金，賈繼明*

(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，石家莊050035)

目的 建立一種同時(shí)測(cè)定人參總皂苷提取物中7種人參皂苷的超高效液相色譜分析方法，該方法對(duì)人參提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)更準(zhǔn)確、更快捷。方法采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；乙腈-水為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速:0.4 mL·min-1；測(cè)定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc 和人參皂苷Rd的含量。結(jié)果測(cè)定的各色譜峰均能達(dá)到基線分離、分離度大于1.5，7種人參皂苷在各自的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，且RSD值符合要求。結(jié)論UPLC能代替HPLC測(cè)定人參皂苷的含量，該方法靈敏、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

人參皂苷；人參總皂苷；超高效液相色譜法

人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖；具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺等功效[1]；始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是一種常用的滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥。人參的主要有效成分為多種人參皂苷類及多糖類成分[2]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證明：人參皂苷(ginsenoside)是人參中重要的活性物質(zhì)，其含量高低是評(píng)價(jià)人參內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[3]。人參多糖具有調(diào)節(jié)免疫活性和抗腫瘤活性、細(xì)胞保護(hù)和降血糖等作用[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rb1等多種抗腫瘤活性成分,其中人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用最顯著，在對(duì)腫瘤的治療研究中被廣泛使用[5]。人參皂苷 Rg1和人參皂苷Rb1作為人參益智作用的主要活性成分，可通過改變腦內(nèi)主要神經(jīng)遞質(zhì)的量、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的蛋白分子等，改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶行為能力[6]。人參皂苷Rg1是人參重要的抗衰老成分，它能有效調(diào)控NSCs 衰老，促進(jìn)其增殖分化，有明確益智與延緩腦衰老的作用[7]。Chen L M等[8]研究了人參皂苷Re對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Re具有較好的腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)潛力；人參皂苷Rb2對(duì)DNA和RNA的合成具有促進(jìn)作用，腦中樞調(diào)節(jié)具有抑制中樞神經(jīng)、降低細(xì)胞內(nèi)鈣、抗氧化、清除體內(nèi)自由基和改善心肌缺血再灌注損傷等作用；人參皂苷Rd主要有抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力和改善心腦血管等作用[9]。

目前,人參皂苷的含量測(cè)定大多是采用HPLC或HPLC-ELSD等方法，在液相色譜法測(cè)定過程中多采用梯度洗脫，雖可進(jìn)行皂苷的測(cè)定，但存在分析時(shí)間長(zhǎng)和響應(yīng)值低等缺點(diǎn)[10]。超高效液相色譜法(UPLC)是中藥研究領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)極大進(jìn)步，卓越的分離度和靈敏度更適合于中藥復(fù)雜樣品的分析，同時(shí)減少了溶劑消耗，極大地縮短了分析時(shí)間[11]。本文采用UPLC法測(cè)定人參總皂苷提取物(樹脂聯(lián)用法即大孔吸附樹脂和弱堿陰離子交換樹脂聯(lián)合使用)中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rd 7種人參皂苷的含量。該測(cè)定方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好[12]，有利于人參總皂苷提取物的質(zhì)量控制。

1　儀器與試藥

1.1儀器Waters Acquity UPLC H-Class，Waters公司；色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Waters公司。

1.2試藥大孔吸附樹脂AB-8，弱堿性陰離子交換樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。對(duì)照品均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，分別為人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-200424)、人參皂苷Re(批號(hào)110754-200822)、人參皂苷Rf(批號(hào)111719-201104)、人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-201122)、人參皂苷Rb2(批號(hào)111715-201203)、人參皂苷Rc(批號(hào)11021-14-0)和人參皂苷Rd(批號(hào)111818-201302)。人參總皂苷提取物自制(批號(hào)：130301,130302,130303)。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的配制分別精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rd對(duì)照品10.1，10.0，9.5，11.7，9.9，9.8和10.1 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配成混合對(duì)照品溶液，測(cè)定前用甲醇稀釋2，4，8，16和32倍，得到系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，備用。見表1。

表1人參總皂苷提取物含量測(cè)定液相條件

Tab.1 The extraction conditions of ginseng total saponins in content determination

時(shí)間/minA,乙腈/%B,水/%01981102575153862204258

2.2供試品溶液的制備精密稱取人參總皂苷提取物30.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，備用。

2.3色譜條件色譜柱:Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃。結(jié)果見圖1。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察精密吸取2.1項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的人參皂苷對(duì)照品溶液2 μL，注入色譜儀，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以人參皂苷的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果顯示其線性關(guān)系良好。其回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取人參皂苷混合對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，7種皂苷峰面積的RSD值為0.83%～1.34%，說明儀器精密度良好。

圖1UPLC圖

A.對(duì)照品；B.人參總皂苷提取物；1.人參皂苷Rg1;2.人參皂苷Re;3.人參皂苷Rf;4.人參皂苷Rb1;5.人參皂苷Rb2;6.人參皂苷Rc;7.人參皂苷Rd

Fig.1 UPLC chromatograms

A.reference substances; B.ginseng total saponin extract；

1.ginsenoside Rg1;2.ginsenoside Re;3.ginsenoside Rf;4.ginsenoside Rb1;5.ginsenoside Rb2;6.ginsenoside Rc;7.ginsenoside Rd

表27種人參皂苷線性關(guān)系

Tab.2 The linear relationships of 7 kinds of ginseng saponins

成分回歸方程線性范圍/μg·mL-1r人參皂苷Rg1Y=47491X-3315612.6～404.00.9998人參皂苷ReY=48150X-3392812.5～400.00.9999人參皂苷RfY=43335X-3466411.8～380.00.9996人參皂苷Rb1Y=53367X-4546214.6～468.00.9991人參皂苷Rb2Y=43786X-3569712.2～392.00.9992人參皂苷RcY=41673X-3114812.3～396.00.9991人參皂苷RdY=45007X-3760212.6～404.00.9991

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將供試品溶液在1，2，4，8，12和24 h分別進(jìn)樣2 μL，記錄峰面積，7種皂苷峰面積RSD值為0.37%～2.63%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取同一份樣品6份，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)定含量，結(jié)果7種人參皂苷峰面積RSD值為0.67%～1.53%，說明重復(fù)性良好。2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知皂苷含量的人參總皂苷提取物15 mg,共6份，分別加入一定量的各皂苷對(duì)照品溶液，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3人參總皂苷提取物7種人參皂苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 The recovery experiment results of 7 kinds of ginseng saponins　(n=6)

2.4.6樣品含量測(cè)定分別取3批人參總皂苷提取物適量,精密稱定， 按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表43批人參總皂苷提取物中7種人參皂苷的含量(%)

Tab.4 3 batches of ginseng total saponins of 7 kinds of ginseng saponin content(%) in the extract

人參皂苷提取物人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rf人參皂苷Rb1人參皂苷Rb2人參皂苷Rc人參皂苷Rd13030120.411.74.224.19.28.45.113030221.111.54.824.69.08.55.413030320.311.34.524.58.48.75.2

3　討論

2015年版《中國(guó)藥典》一部中人參皂苷含量測(cè)定需要時(shí)間100 min，本文建立超高效液相色譜法的色譜條件可以在20 min內(nèi)使7種人參皂苷得到很好的分離，方法靈敏、快速，為人參皂苷的質(zhì)量控制提供了準(zhǔn)確、可靠的測(cè)定方法。

作者經(jīng)過大量地液相梯度洗脫條件摸索，曾采用甲醇-水、甲醇-5 mL·L-1磷酸水、乙腈-水和乙腈-5 mL·L-1磷酸水等不同洗脫系統(tǒng)，在乙腈-水系統(tǒng)下，7種人參皂苷類成分的分離度均大于1.5，且峰形較好。因此采用乙腈-水為該實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。比較25,30和35 ℃等不同溫度下色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，30 ℃下柱壓較低且分離效果最佳，因此確定柱溫為30 ℃。

色譜柱的選擇：作者比較了Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱，Waters Acquity CSH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱和Waters Acquity HSS T3色譜柱，結(jié)果表明，Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱分離效果較好，該方法使各峰均能達(dá)到基線分離，能精確地測(cè)定人參皂苷的含量。

研究結(jié)果表明，本文建立的UPLC測(cè)定7種人參皂苷含量的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高,可以實(shí)現(xiàn)人參提取物的多指標(biāo)質(zhì)量控制,為測(cè)定人參皂苷提供了可靠的分析方法。

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Determination of 7 kinds of ginsenosides in Panax ginseng in the extract of Ginseng radix by UPLC

CAI Yan,SONG Jian,WANG Guijin, JIA Jiming*

(Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Limited Company, Shijiazhuang 050035，China)

Objective To establish a UPLC method for the determination of 7 kinds of ginseng saponins in the extract of total saponins ofPanaxginseng.The method was aimed to be more accurate and efficient for the quality evaluation of the extracts.Methods Ginsenoside Rg1,Re,Rf,Rb1,Rb2,Rc and Rd were separated by Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);the mobile phase was acetonitrile-water with a flow rate of 0.4 mL·min-1and the detection wavelength was 203 nm.Result The peaks were reached baseline separation.The separation factor was bigger than 1.5. There were good linear relationships of the 7 kinds of ginsenoside, and the RSD value was in line with the requirements.Conclusion UPLC can replace HPLC method for the determination of the contents of ginsenosides.The method is sensitive, simple, accurate and reproducible.

ginsenoside; general ginsenoside; UPLC

國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目 (編號(hào)：81102768)

蔡艷，女，碩士，工程師

賈繼明，男，博士，正高級(jí)工程師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.001

R927.2

A

1004-2407(2016)05-0441-04

2016-03-16)