黃風(fēng)玲，楊 穎，張瑞麗，毛 睿，劉 攀，孫 毅，張 華，包永星

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肝細(xì)胞癌組織中高爾基體蛋白73和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及Smad2的表達(dá)水平及其意義

黃風(fēng)玲，楊 穎，張瑞麗，毛 睿，劉 攀，孫 毅，張 華，包永星

目的探討高爾基體蛋白73(GP73)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smads信號(hào)通路與肝細(xì)胞癌(肝癌)的關(guān)系。方法選取2010年1月—2014年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科收集的80例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織蠟塊標(biāo)本，并從本院病案室調(diào)閱患者的臨床病歷資料，包括性別、年齡、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、有無(wú)肝硬化、有無(wú)門(mén)靜脈癌栓、分化程度、TNM分期、有無(wú)血管侵犯。采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織GP73、TGF-β1和Smad2的陽(yáng)性表達(dá)情況和積分光密度(IOD)。結(jié)果GP73定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。肝癌組織GP73陽(yáng)性表達(dá)率為73.8%(59/80)，高于癌旁組織的5.0%(4/80)(χ2=76.50，P<0.05)。TGF-β1和Smad2主要表達(dá)于胞質(zhì)，偶見(jiàn)于胞核，為棕黃色深染顆粒。肝癌組織TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率為81.2%(65/80)，高于癌旁組織的6.2%(5/80)(χ2=65.67，P<0.05)；肝癌組織Smad2陽(yáng)性表達(dá)率為66.2%(53/80)，高于癌旁組織的10.0%(8/80)(χ2=47.62，P<0.05)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，GP73與TGF-β1、Smad2呈正相關(guān)(rs=0.841、0.405，P<0.05)。不同性別患者肝癌組織GP73、Smad2表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGF-β1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、HBsAg、AFP、有無(wú)肝硬化及門(mén)靜脈癌栓患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同分化程度、TNM分期、有無(wú)血管侵犯患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論GP73在肝癌組織中多呈陽(yáng)性表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

癌，肝細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；Smad2蛋白質(zhì)；高爾基體蛋白73

黃風(fēng)玲，楊穎，張瑞麗，等.肝細(xì)胞癌組織中高爾基體蛋白73和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及Smad2的表達(dá)水平及其意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(26)：3191-3195.[www.chinagp.net]

HUANG F L，YANG Y，ZHANG R L，et al.Expression level and significance of GP73，TGF-β1and Smad2 in hepatocellular carcinoma tissues[J].Chinese General Practice，2016，19(26)：3191-3195.

肝細(xì)胞癌(肝癌)是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)全球最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌發(fā)病率在全身惡性腫瘤中位居第6位，病死率位居第2位；在我國(guó)形勢(shì)更加嚴(yán)峻，發(fā)病和死亡人數(shù)占全球50%以上，堪稱(chēng)肝癌大國(guó)[1]。高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是一種新穎的Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，是潛在的肝癌血清腫瘤標(biāo)志物，然而其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制尚罕見(jiàn)報(bào)道。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種多功能的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的TGF-β/Smads信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法，對(duì)肝癌組織及癌旁組織中GP73、TGF-β1和Smad2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，從組織學(xué)水平上初步探討GP73及TGF-β/Smads信號(hào)通路與肝癌發(fā)生/發(fā)展的可能機(jī)制，為進(jìn)一步在分子學(xué)水平上探討肝癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1組織標(biāo)本經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2010年1月—2014年12月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科收集的80例肝癌患者的肝癌組織及癌旁組織蠟塊標(biāo)本，并從本院病案室調(diào)閱該80例患者的臨床病歷資料，包括性別、年齡、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、有無(wú)肝硬化、有無(wú)門(mén)靜脈癌栓、分化程度、TNM分期、有無(wú)血管侵犯。80例患者病歷資料完整；術(shù)前均未行放療、化療、射頻消融及生物治療等內(nèi)科治療，術(shù)后病理學(xué)確診為肝癌；組織蠟塊均經(jīng)病理科兩名資深醫(yī)生進(jìn)行HE染色，形態(tài)符合肝癌確診依據(jù)[2]。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器兔抗人GP73多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司，兔抗人TGF-β1多克隆抗體

1.2.2GP73、TGF-β1和Smad2檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織GP73、TGF-β1和Smad2的表達(dá)情況。組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片經(jīng)烤箱脫蠟后水化，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波爐枸櫞酸抗原修復(fù)液修復(fù)，冷卻后滴加一抗4 ℃冰箱過(guò)夜。每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照為兔抗人GP73多克隆抗體、兔抗人TGF-β1多克隆抗體和兔抗人Smad2多克隆抗體，陰性對(duì)照為不加抗體的PBS；一抗工作液體濃度均為1∶50。次日滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃溫箱孵育30 min，光鏡下觀察二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。

1.2.3結(jié)果判定(1)由兩名病理科醫(yī)生根據(jù)染色強(qiáng)度獨(dú)立進(jìn)行結(jié)果判定，以胞質(zhì)顯色為棕黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞；按照著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。使用ImageJ2x圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性部位面積的百分比，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取其平均值為該張切片的陽(yáng)性表達(dá)面積；按照陽(yáng)性表達(dá)面積百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性表達(dá)面積為0分，1%～20%為1分，21%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。兩項(xiàng)得分相乘，0～1分為“-”，2～4分為“+”，5～7分為“++”，8～12分為“+++”。將“-～+”定義為蛋白低表達(dá)即陰性表達(dá)，將“++～+++”定義為蛋白高表達(dá)即陽(yáng)性表達(dá)。(2)應(yīng)用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍(×200)視野，分別對(duì)各組5個(gè)視野中的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行積分光密度(integral optical density，IOD)測(cè)定，然后計(jì)算平均IOD。

2　結(jié)果

2.1肝癌組織和癌旁組織GP73、TGF-β1和Smad2陽(yáng)性表達(dá)率比較GP73定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(見(jiàn)圖1，本文彩圖詳見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。肝癌組織GP73陽(yáng)性表達(dá)率為73.8%(59/80)，癌旁組織GP73陽(yáng)性表達(dá)率為5.0%(4/80)，兩者GP73陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=76.50，P<0.05)。TGF-β1和Smad2主要表達(dá)于胞質(zhì)，偶見(jiàn)于胞核，為棕黃色深染顆粒(見(jiàn)圖2、3)。肝癌組織TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率為81.2%(65/80)，癌旁組織TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率為6.2%(5/80)，兩者TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=65.67，P<0.05)；肝癌組織Smad2陽(yáng)性表達(dá)率為66.2%(53/80)，癌旁組織Smad2陽(yáng)性表達(dá)率為10.0%(8/80)，兩者Smad2陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=47.62，P<0.05)。

2.2肝癌組織GP73與TGF-β1、Smad2的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，GP73與TGF-β1、Smad2呈正相關(guān)(rs=0.841、0.405，P<0.05)。

2.3不同臨床特征患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平比較不同性別患者肝癌組織GP73、Smad2表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TGF-β1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、HBsAg、AFP、有無(wú)肝硬化及門(mén)靜脈癌栓患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同分化程度、TNM分期、有無(wú)血管侵犯患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

圖1　GP73在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)DAB顯色，×400)

Figure1ExpressionofGP73inhepatocellularcarcinomatissuesandpara-carcinomatissues

圖2　TGF-β1在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)DAB顯色，×400)

圖3　Smad2在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)DAB顯色，×400)

3　討論

表1　不同臨床特征患者肝癌組織GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平比較±s)

注：IOD=積分光密度，GP-73=高爾基體蛋白73，TGF-β1=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，HBsAg=乙型肝炎表面抗原，AFP=甲胎蛋白

GP73是一種新近發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型高爾基體跨膜糖蛋白，因其在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳中顯示相對(duì)分子量為7.3×104而得名。2000年，KLADNEY等[3]在構(gòu)建成人巨大細(xì)胞性肝炎(giant cell hepatitis，GCH)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)GP73，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝硬化患者肝組織中GP73的表達(dá)明顯高于正常組[4]。2004年，MAITRA等[5]研究發(fā)現(xiàn)GP73可以在血清中檢測(cè)到，并認(rèn)為GP73可以作為肝臟疾病的標(biāo)志物。在亞洲人群的研究中，毛一雷等[6]初步確立了我國(guó)正常人GP73參考范圍，并說(shuō)明GP73不但可以作為診斷肝癌的敏感性指標(biāo)，而且對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后有一定的價(jià)值。同時(shí)，本課題組前期研究也證實(shí)血清GP73水平在肝癌患者中升高最為明顯，臨床上認(rèn)為其可能成為肝癌早期診斷的理想標(biāo)志物[7-9]。

2011年腫瘤權(quán)威教授CHAFFER等[10]指出腫瘤細(xì)胞只有發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)具備了運(yùn)動(dòng)侵襲能力，才能進(jìn)行局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此研究肝癌發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子及信號(hào)通路對(duì)阻斷肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展有非常重要的意義。2013年本課題組就GP73在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，GP73與EMT關(guān)系密切，發(fā)生EMT的主要分子特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白(Vimentin)表達(dá)上調(diào)[11-12]。2014年ZHANG等[13]首先報(bào)道在肝癌細(xì)胞株HepG2及BEL-7402中應(yīng)用siRNA對(duì)GP73進(jìn)行干擾后亦提示GP73在肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制中起到重要作用。目前盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)GP73作為肝癌相關(guān)性蛋白的研究已取得一定進(jìn)展，但是，絕大多數(shù)研究?jī)H停留在GP73作為肝癌血清腫瘤標(biāo)志物的方向，其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制未明確闡明，嚴(yán)重阻礙其臨床價(jià)值的轉(zhuǎn)化。

EMT的發(fā)生涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，其分子通路十分復(fù)雜，但在誘導(dǎo)EMT發(fā)生的眾多細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子中，TGF-β被證實(shí)是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵因子，TGF-β共有3種，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1在腫瘤中主要參與刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡等精細(xì)調(diào)節(jié)活動(dòng)，近年來(lái)諸多研究報(bào)道TGF-β能夠誘導(dǎo)體內(nèi)、體外多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入外源性TGF-β后獲得EMT特征，侵襲、轉(zhuǎn)移能力增加；反之抑制TGF-β信號(hào)通路后能逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。TGF-β在EMT中起著中心作用，即腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子事件。TGF-β介導(dǎo)EMT主要涉及Smad依賴(lài)[16]和Smad非依賴(lài)[17]兩條信號(hào)通路。在Smad依賴(lài)信號(hào)通路中，TGF-β與細(xì)胞膜上Ⅱ型受體結(jié)合，Ⅱ型受體激酶誘導(dǎo)Ⅰ型受體磷酸化，并與Smad2/3形成復(fù)合物。Smad2/3磷酸化后，與Smad4形成異三聚體或四聚體，使E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Vimentin表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)EMT發(fā)生。因此本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法在組織學(xué)水平初步探討GP73與TGF-β/Smads信號(hào)通路的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，80例組織蠟塊中GP73和TGF-β1、Smad2在肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，并且Spearman相關(guān)分析顯示，在肝癌組織中GP73與TGF-β1、Smad2均呈正相關(guān)，GP73、TGF-β1和Smad2表達(dá)水平與肝癌的分化程度、TNM分期及血管侵犯關(guān)系密切。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，GP73的表達(dá)與TGF-β/Smads信號(hào)通路關(guān)系密切，但其具體作用機(jī)制及是否還有其他信號(hào)通路的參與，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝癌的發(fā)生與發(fā)展，有待進(jìn)一步的分子水平實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：黃風(fēng)玲、楊穎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；張瑞麗、毛睿、劉攀、孫毅、張華進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；包永星進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Expression Level and Significance of GP73，TGF-β1and Smad2 in Hepatocellular Carcinoma Tissues

HUANGFeng-ling，YANGYing，ZHANGRui-li，MAORui，LIUPan，SUNYi，ZHANGHua，BAOYong-xing.TumorCenter，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China

Correspondingauthor：BAOYong-xing，TumorCenter，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China；E-mail：baoyx@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate the relationship between Golgi protein 73(GP73)，TGF-β/Smads signaling pathway and hepatocellular carcinoma.Methods80 cases of paraffin-embedded samples of hepatocellular carcinoma tissues and para-carcinoma tissues collected by Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected from January 2010 to December 2014.And clinical data of these patients were consulted from the Medical Records Room of our hospital，including gender，age，hepatitis B surface antigen(HBsAg)，alpha fetoprotein(AFP)level，with or without liver cirrhosis，with or without portal vein tumor thrombus，differentiation degree，TNM staging，with or without vascular invasion.Immunohistochemistry EnVision system was adopted to detect positive expression and IOD of GP73 and TGF-β1，Smad2 in hepatocellular carcinoma tissues and para-carcinoma tissues.ResultsGP73，claybank particles，were located in cytoplasm.The positive expression rate of GP73 in hepatocellular carcinoma tissues was 73.8%(59/80)，higher than 5.0%(4/80)(χ2=76.50，P<0.05) of para-carcinoma tissues.TGF-β1，Smad2 mainly expressing in cytoplasm，occasionally in karyon，were claybank dense granule.TGF-β1positive expression rate in hepatocellular carcinoma tissues was 81.2%(65/80)，higher than 6.2%(5/80)(χ2=65.67，P<0.05)of para-carcinoma tissues.Smad2 positive expression rate in hepatocellular carcinoma tissues was 66.2%(53/80)，higher than 10.0%(8/80)(χ2=47.62，P<0.05)of para-carcinoma tissues.Spearman relevant analysis results showed that GP73 correlated positively with TGF-β1，Smad2(rs=0.841，0.405，P<0.05).The comparison of the expression levels of GP73，Smad2 in patients with different gender were not statistically significant(P>0.05)，the comparison of the expression levels of TGF-β1in patients with different gender was statistically significant(P<0.05)；the comparison of the expression levels of GP73，TGF-β1and Smad2 in patients with different age，HBsAg，AFP，with or without liver cirrhosis，with or without portal vein tumor thrombus were not statistically significant(P>0.05)；the comparison of the expression levels of GP73，TGF-β1and Smad2 in patients with different differentiation degree，TNM staging，with or without vascular invasion were all statistically significant(P<0.05).ConclusionGP73，mainly expressing positively in hepatocellular carcinoma tissues，may be involved in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma through the regulation of TGF-β/Smads signaling pathway.

Carcinoma，hepatocellular；Transforming growth factor beta1；Smad2 protein；Golgi protein 73

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014211C070)

830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心

包永星，830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心；E-mail：baoyx@vip.sina.com

R 730.261

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.26.013

2016-01-12；

2016-05-13)