龐春艷，王　蓓，劇錦哲，王永福

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所/包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

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α-胞襯蛋白siRNA對(duì)人涎腺導(dǎo)管細(xì)胞的影響*

龐春艷，王蓓，劇錦哲，王永?！?/p>

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所/包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

目的觀察α-胞襯(α-Fodrin)蛋白小干擾RNA(siRNA)對(duì)人涎腺導(dǎo)管(HSG)細(xì)胞的影響，探討α-Fodrin siRNA治療干燥綜合征(SS)的作用。方法實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、空載體組、α-Fodrin siRNA1組及α-Fodrin siRNA2組，將成功構(gòu)建的10 μg α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2表達(dá)載體分別采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HSG細(xì)胞，空載體組HSG細(xì)胞轉(zhuǎn)染等劑量的pGFP-V-RS空載體。轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR法檢測(cè)4組HSG細(xì)胞中α-Fodrin mRNA的表達(dá)水平；細(xì)胞熒光免疫法檢測(cè)4組細(xì)胞中α-Fodrin蛋白的表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)4組細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-10的表達(dá)水平。結(jié)果轉(zhuǎn)染后48 h HSG細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高；轉(zhuǎn)染后48 h α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組 HSG細(xì)胞中α-Fodrin mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和空載體組(P<0.05)，且α-Fodrin siRNA2組中α-Fodrin mRNA的表達(dá)水平低于α-Fodrin siRNA1組的表達(dá)水平(P<0.05)；α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細(xì)胞上清液中IL-10的水平明顯升高，較對(duì)照組和空載體組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細(xì)胞上清中IFN-γ的水平低于對(duì)照組和空載體組，但 4組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論HSG細(xì)胞轉(zhuǎn)染α-Fodrin siRNA載體后，α-Fodrin mRNA和蛋白的表達(dá)水平下降，同時(shí)細(xì)胞上清中IL-10的水平升高、IFN-γ水平下降，提示α-Fodrin siRNA可以減輕炎性反應(yīng)，為SS的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

RNA,小分子干擾；α-胞襯蛋白；人涎腺導(dǎo)管細(xì)胞；白細(xì)胞介素-10；干擾素-γ

α-胞襯(α-Fodrin)蛋白是從干燥綜合征(sj?gren′s syndrome，SS)小鼠唇腺中提取的涎腺特異性自身抗原，在SS的發(fā)病過(guò)程中起非常重要的作用，對(duì)SS的診斷和指導(dǎo)治療都起到了很好的作用，有較好的特異度和靈敏度[1-2]。人涎腺導(dǎo)管(human salivary gland cells,HSG)細(xì)胞來(lái)源于人下頜下腺的閏管上皮，常作為研究SS的細(xì)胞模型。本研究采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)沉默HSG細(xì)胞中α-Fodrin 基因的表達(dá)，探討α-Fodrin基因的siRNA對(duì)HSG細(xì)胞的可能作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑載體pGFP-V-RS和TRIzol分別購(gòu)自O(shè)rigene和Takara公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、脂質(zhì)體lipofectamineTM2000和標(biāo)記有紅色熒光的二抗購(gòu)自Invitrogen公司，ELISA試劑盒為RD國(guó)內(nèi)分裝試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程有限責(zé)任公司，兔抗人的一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2siRNA的設(shè)計(jì)針對(duì)人α-Fodrin基因的cDNA序列(序列號(hào):XM_006717254)，根據(jù)siRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)設(shè)計(jì)2段siRNA序列，分別位于全序列的第238～256位和第405～423位，第1段序列為：CCC TTA GGC GTC AGA AGC T，第2段序列為：GCT GAA GTG CAG GCC AAC T，這2段siRNA序列的GC含量是一樣的，只是在人α-Fodrin全序列的位置不同。本實(shí)驗(yàn)將上述2段序列的模板插入質(zhì)粒載體pGFP-V-RS的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建2段α-Fodrin 的siRNA真核表達(dá)載體。

1.3細(xì)胞水平的各項(xiàng)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)分4組，分別為對(duì)照組、空載體組、α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組，將α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組中的HSG細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染α-Fodrin siRNA1和α-Fodrin siRNA2真核表達(dá)載體10 μg和脂質(zhì)體lipofectamineTM2000的混合物(比例為1∶3)，對(duì)照組轉(zhuǎn)染等劑量空載體與lipofectamineTM2000的混合物(比例為1∶3)。轉(zhuǎn)染48 h后，采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中α-Fodrin mRNA和內(nèi)參GAPDH的Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt。同時(shí)，4組細(xì)胞做細(xì)胞熒光免疫檢測(cè)染色，圖片采用IPP6軟件分析平均OD值；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-10的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IFN-γ和IL-10的水平。

2　結(jié)　　果

2.1成功構(gòu)建α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建的2段α-Fodrin siRNA真核表達(dá)載體送invitrogen公司進(jìn)行DNA基因測(cè)序分析，結(jié)果顯示α-Fodrin的2段siRNA序列已準(zhǔn)確無(wú)誤地插入質(zhì)粒載體pGFP-V-RS中，見(jiàn)圖1。

2.2熒光顯微鏡觀察HSG細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體和空載體轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光最亮最多，見(jiàn)圖2，即細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高。

2.3α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48 h后α-Fodrin mRNA的表達(dá)水平HSG細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組α-Fodrin mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48 h后α-Fodrin蛋白的表達(dá)水平HSG細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞熒光免疫的結(jié)果顯示：α-Fodrin siRNA1組的平均OD值為(0.011 9±0.000 6)，α-Fodrin siRNA2組的平均OD值為(0.008 6±0.000 6)，對(duì)照組的平均OD值為(0.014 7±0.000 7)和空載體組的平均OD值為(0.016 7±0.001 9)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組α-Fodrin蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)α-Fodrin siRNA2組的α-Fodrin蛋白的表達(dá)低于siRNA1組，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組和空載體組α-Fodrin蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

A:α-Fodrin siRNA1組；B:α-Fodrin siRNA2組。

圖1α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體(10×20)

A：HSG細(xì)胞的明視野；B：A對(duì)應(yīng)的綠色熒光。

圖2　　HSG細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(10×20) 表1　　4組細(xì)胞中α-Fodrin mRNA表達(dá)水平

A：對(duì)照組；B：空載體組；C：α-Fodrin siRNA1組；D：α-Fodrin siRNA2組。

圖34組HSG細(xì)胞中α-Fodrin蛋白的表達(dá)水平

2.5α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞上清中IFN-γ的表達(dá)水平細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細(xì)胞上清中IFN-γ的水平低于對(duì)照組和空載體組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，4組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2　　4組細(xì)胞上清中IFN-γ表達(dá)水平

2.6α-Fodrin的siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞上清中IL-10的表達(dá)水平細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組細(xì)胞上清中IL-10的水平高于對(duì)照組和空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3　　4組細(xì)胞上清中IL-10表達(dá)水平

3　討　　論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就引起了研究者的極大關(guān)注，因其具有高效性、特異性等優(yōu)點(diǎn)，這使得RNAi技術(shù)廣泛用于基因功能和治療多種疾病等方面的研究，尤其是用于治療自身免疫性疾病[3-5]、腫瘤[6-7]的研究。Pauley等[3]將 caspase-3的特異性siRNA序列和M3受體激動(dòng)劑膽堿連接，轉(zhuǎn)染HSG細(xì)胞，以受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞的方式將siRNA帶入HSG細(xì)胞內(nèi)，它可以明顯抑制caspase-3在基因和蛋白水平的表達(dá)。Yu等[8]構(gòu)建TNF-α siRNA的腺病毒載體注射小鼠，可有效沉默小鼠假體周圍組織中的TNF-α的表達(dá)，從而抑制骨溶解。

Fodrin在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞均有表達(dá)，本研究成功構(gòu)建的2段siRNA真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HSG細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-Fodrin siRNA1組和siRNA2組中HSG細(xì)胞的α-Fodrin mRNA的表達(dá)與對(duì)照組和空載體組比較明顯下降，充分說(shuō)明α-Fodrin的特異性siRNA能在基因水平上沉默其表達(dá)。本研究進(jìn)一步采用細(xì)胞熒光免疫法檢測(cè)HSG細(xì)胞中α-Fodrin的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：α-Fodrin siRNA1組和α-Fodrin siRNA2組α-Fodrin的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組和空載體組比較明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明α-Fodrin siRNA能抑制α-Fodrin在蛋白水平的表達(dá)。

Th依據(jù)分泌細(xì)胞因子模式的不同分為Th1和Th2，Th1主要分泌IFN-γ等，Th2主要分泌IL-4、IL-6等，Th1和Th2在體內(nèi)保持平衡，二者的失衡在自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[9-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，α-Fodrin的siRNA作用HSG細(xì)胞后，IL-10的水平明顯升高，而IFN-γ的水平下降，但不明顯。提示α-Fodrin的siRNA可以減輕炎性反應(yīng)，同時(shí)逆轉(zhuǎn)HSG細(xì)胞中Th1和Th2的失衡，使二者保持平衡。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的第2段siRNA序列抑制α-Fodrin mRNA和蛋白水平的表達(dá)作用強(qiáng)于第1段siRNA序列，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩段siRNA序列對(duì)IFN-γ和IL-10的作用沒(méi)有明顯差別。提示本實(shí)驗(yàn)的第2段siRNA序列具有更好的基因沉默效果，但對(duì)炎性反應(yīng)的作用沒(méi)有明顯差別。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-Fodrin的siRNA可以降低Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子，升高Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子，逆轉(zhuǎn)Th1和Th2的失衡，保持Th1和Th2的平衡。本課題組從細(xì)胞水平觀察了α-Fodrin siRNA對(duì)HSG細(xì)胞的作用，為SS的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究采用構(gòu)建α-Fodrin siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h轉(zhuǎn)染效率最高，但經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定也只能達(dá)到40% 左右，因此，α-Fodrin siRNA雖然能抑制α-Fodrin mRNA和蛋白水平的表達(dá)，但檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子卻沒(méi)有明顯的改變，可能和其轉(zhuǎn)染效率不是很高有關(guān)系。接下來(lái)本研究團(tuán)隊(duì)將構(gòu)建腺病毒載體，從而大幅度提高其感染HSG細(xì)胞的效率，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化，進(jìn)行深入研究。此外，本研究只是通過(guò)檢測(cè)部分細(xì)胞因子的表達(dá)而間接推測(cè)T細(xì)胞亞群的變化，而不是直接證明T細(xì)胞亞群的變化，因此是不充分的。后續(xù)本團(tuán)隊(duì)將研究siRNA對(duì)SS患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞或SS動(dòng)物模型NOD小鼠脾細(xì)胞的作用，從而直接說(shuō)明siRNA對(duì)T細(xì)胞亞群的影響。

[1]秦琴，孫懿，谷明莉，等．抗α-胞襯蛋白抗體對(duì)干燥綜合征的診斷價(jià)值:一項(xiàng)Meta分析[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(12)：1074-1079．

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論著·臨床研究

論著·基礎(chǔ)研究

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.006

Effect of α-Fodrin siRNA on human salivary gland cells*

PangChunyan,WangBei,JuJinzhe,WangYongfu△

(InstituteofRheumatologyofBaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology/DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou,Mongolia014010,China)

ObjectiveTo observe the effect of α-Fodrin siRNA on human salivary gland(HSG)cells and to discuss its therapy on sj?gren′s syndrome(SS).MethodsThe vectors expressing siRNA against α-Fodrin of human were transfected into HSG cells of 10 μg α-fodrin siRNA1 group and α-Fodrin siRNA2 group,while pGFP-V-RS vector were transfected into the cells of empty vector group，there was no handling in HSG cell of control group.The efficiency was observed by fluorescence microscope after transfection of 24,48,72 and 96 h by lipofectamine 2000.The expression levels of α-Fodrin mRNA and protein of HSG were detected by real-time(RT)-PCR and immunohistochemistry method respectively.The expression levels of IFN-γ and IL-10 in supernatant of cells were detected by ELISA.ResultsThe efficiency was highest on 48 h after transfection.The level of α-Fodrin mRNA and protein was lower in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group than control group and empty vector group on 48 h after transfection (P<0.05),the level of α-Fodrin mRNA in α-fodrin siRNA2 group was significant higher than α-fodrin siRNA1 group (P<0.05).The levels of IL-10 were higher in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group than control group and empty vector group on 48 h after transfection (P<0.05),α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group had no statistical significance(P>0.05).The levels IFN-γ in α-fodrin siRNA1 group and α-fodrin siRNA2 group were lower than of control group and empty vector group on 48 h after transfection,but there were no significant differences in the four groups (P>0.05).ConclusionThe α-fodrin siRNA1 and α-fodrin siRNA2 can suppress the levels of α-fodrin mRNA and protein of HSG cells,at the same time;they can elevate the expression of IL-10 and decrease the level of IFN-γ.So α-Fodrin siRNA reduce the levels of inflammatory cytokines and provide experimental basis to therapy of SS.

RNA,small interfering;α-Fodrin protein;human salivary gland cells;interleukin-10;interferon-γ

包頭市醫(yī)藥衛(wèi)生基金項(xiàng)目(2009S1001-34)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20120403)。作者簡(jiǎn)介：龐春艷(1978-)，主管檢驗(yàn)師，碩士，主要從事免疫性疾病研究工作。△

，E-mail:wyf5168@hotmail.com。

R373.9

A

1671-8348(2016)07-0880-03

2015-09-18

2015-11-28)

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.007

胡輔華(1973-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事眼科疾病研究工作。