朱葵向，金妙玲

多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥基因分析

朱葵向，金妙玲

目的探討多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及其相關(guān)的耐藥基因。方法采用肉湯稀釋藥敏板法測(cè)定56株銅綠假單胞菌對(duì)21種抗菌藥物的敏感性，同時(shí)采用聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）檢測(cè)56株銅綠假單胞菌的相關(guān)耐藥基因及外膜通道蛋白o(hù)prD2基因。結(jié)果56株多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶、氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、復(fù)方磺胺甲惡唑、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、妥布霉素、替卡西林及頭孢唑林耐藥率為100.0%，頭孢呋辛的耐藥率為94.6%，亞胺培南的耐藥率為89.3%，美羅培南的耐藥率為83.9%；耐藥基因檢測(cè)陽性率最高的是膜通道蛋白o(hù)prD2基因，陽性率為92.9%。結(jié)論多重耐藥銅綠假單胞菌存在耐藥基因，A類與D 類 -內(nèi)酰胺酶基因的存在使得其對(duì)頭孢菌素產(chǎn)生耐藥，對(duì)亞胺培南產(chǎn)生耐藥主要與oprD2基因的存在有關(guān)。

銅綠假單胞菌；微生物敏感性試驗(yàn)；多重耐藥；基因

銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，屬于非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是皮膚軟組織、呼吸道和醫(yī)院內(nèi)等感染最常見的條件致病菌。近年來，由于廣泛過度使用 -內(nèi)酰胺類抗生素、碳青酶烯酶的產(chǎn)生及廣泛開展各種有創(chuàng)診療操作，使得銅綠假單胞菌的耐藥性不斷上升，其對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制包括多種 -內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷類修飾酶的產(chǎn)生、外膜通道蛋白D2（OprD2）的缺失、外排泵及靶向突變等[1]。多重耐藥銅綠假單胞菌菌株的出現(xiàn)，不僅使臨床上的抗感染治療面臨諸多困難和挑戰(zhàn)，而且也容易導(dǎo)致醫(yī)院暴發(fā)和流行大規(guī)模的感染[2]。本研究旨在探討分析臨床上分離出的多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及其相關(guān)的耐藥基因，為臨床上進(jìn)一步合理應(yīng)用抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)，報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1菌株來源選取2014年6月至2015年6月浙江省浦江縣人民醫(yī)院分離并鑒定的銅綠假單胞菌56株，均來自于住院患者的痰液、尿液及傷口分泌物等各類標(biāo)本。質(zhì)控菌株購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，包括：銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）。

1.2藥敏實(shí)驗(yàn)采用肉湯稀釋藥敏板法測(cè)定56株銅綠假單胞菌對(duì)21種抗菌藥物的敏感性，判斷標(biāo)準(zhǔn)為CLSI2009。21種抗菌藥物均為為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。1.3儀器與試劑采用聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）檢測(cè)56株銅綠假單胞菌的相關(guān)耐藥基因及外膜通道蛋白 oprD2基因，PCR儀為AB stepone real-time PCR system，所需要的引物委托上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任有限公司進(jìn)行合成；所需要的Taq酶、PCR試劑及DNA標(biāo)志物購(gòu)買于Fermentas公司。

1.4耐藥基因檢測(cè)挑純培養(yǎng)菌落置入0.5 ml離心管內(nèi)（內(nèi)已預(yù)置200 ng/ml蛋白酶K溶液）。56℃水浴2h，改95℃水浴10 min。15 000 r/min離心30 s，移液器吸取上清液移入另一新的0.5ml離心管作為模板液置入―20℃冰箱備用。采用PCR擴(kuò)增，按常規(guī)方法建立PCR體系，PCR引物序列見文獻(xiàn)[2-3]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任有限公司進(jìn)行DNA雙向序列測(cè)定。

2　結(jié)果

2.1多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的藥敏率56株多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶、氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、復(fù)方磺胺甲惡唑、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、妥布霉素、替卡西林、頭孢唑林耐藥率為100.0%，頭孢呋辛的耐藥率為94.6%，亞胺培南的耐藥率為89.3%，美羅培南的耐藥率為83.9%，見表1。

表1　56株多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的藥敏率　株（%）

2.2多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測(cè)56株多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測(cè)陽性率最高的是膜通道蛋白o(hù)prD2基因，陽性率為92.9%，見表2。

表2　56株多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測(cè)陽性率

3　討論

近年來，臨床上廣泛使用廣譜抗菌藥物，使得銅綠假單胞菌耐藥性越來越嚴(yán)重，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床抗感染治療和控制醫(yī)院內(nèi)感染帶來了巨大的困難。所以，對(duì)醫(yī)院多重耐藥銅綠假單胞菌菌株的耐藥基因情況進(jìn)行充分的了解，分析其耐藥機(jī)制，對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)及醫(yī)院感染的控制具有重大的意義[3-4]。

目前，治療銅綠假單胞菌感染最主要的一類抗菌藥物為 -內(nèi)酰胺類，隨著臨床上對(duì)其大規(guī)模使用，銅綠假單胞菌對(duì)其耐藥性日益顯現(xiàn)，大多是在抗菌藥物治療過程中獲得或者相應(yīng)基因表達(dá)發(fā)生改變而出現(xiàn)繼發(fā)耐藥。主要的耐藥機(jī)制為產(chǎn)生了 -內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白o(hù)prD2表達(dá)減弱或缺失。外膜蛋白o(hù)prD2是亞胺培南進(jìn)入菌體特異性通道，如果菌株存在膜通道蛋白o(hù)prD2基因，就會(huì)抑制 oprD2蛋白的生物活性甚至導(dǎo)致oprD2蛋白缺損，從而對(duì)亞胺培南表現(xiàn)耐藥。本研究顯示，膜通道蛋白o(hù)prD2基因檢測(cè)的陽性率為92.9%，與亞胺培南耐藥率89.3%比較接近，表現(xiàn)為基因型與表型的相對(duì)一致，所以oprD2基因的存在是銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南抗菌藥物耐藥的主要原因。亞胺培南與美羅培南兩者似乎不存在交叉耐藥，其原因可能與美羅培南不通過oprD2進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)有關(guān)。但是，由于美羅培南是銅綠假單胞菌主動(dòng)外排系統(tǒng) MexAB-OprM的底物，本研究的耐藥率達(dá)83.9%，存在繼發(fā)耐藥的可能[5-6]。

綜上所述，對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)酶機(jī)制和耐藥機(jī)制進(jìn)行深入了解和研究，加強(qiáng)對(duì)其耐藥性的常規(guī)監(jiān)測(cè)，將有助于制定科學(xué)的治療方案，對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)及醫(yī)院感染的控制具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.02.039

R446.5

A

1671-0800(2016)02-0215-02

2015-10-10

（本文編輯：孫海兒）

322200浙江省浦江，浦江縣人民醫(yī)院

朱葵向，Email:Zhukx 1971@126.com