趙 晨，付 瑩，林華英，孫震曉（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 000；.中國海洋大學(xué)海洋生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 66003）

毛蚶抗癌活性蛋白對K562細胞增殖和凋亡的影響

趙 晨1，付 瑩1，林華英2，孫震曉1
（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國海洋大學(xué)海洋生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266003）

目的考察毛蚶抗癌蛋白（ASAP）活性組分體外對人慢性粒細胞性白血病K562細胞的細胞毒作用，初步探討其作用機制。方法 ASAP由毛蚶軟體經(jīng)常規(guī)低溫水提和硫酸銨沉淀法制備；Bradford法測定ASAP樣品的蛋白質(zhì)濃度，計算蛋白質(zhì)含量；倒置相差顯微鏡下觀察ASAP作用后K562細胞形態(tài)變化，姬姆薩染色觀察細胞和細胞核的變化；MTT法檢測ASAP對K562細胞存活的影響；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期的變化；Western蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞凋亡和細胞周期相關(guān)蛋白胱天蛋白酶原3（35 ku），胱天蛋白酶3（17 ku），程序性細胞死亡因子4（PDCD4）和P53的表達。結(jié)果 MTT實驗結(jié)果表明，ASAP 50，100和200 mg·L-1作用24～72 h對K562細胞增殖具有明顯的抑制作用，呈時間和濃度依賴性，24，48和72 h的濃度-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.851，0.8977和0.8997（P＜0.01）。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ASAP 200 mg·L-1作用48 h，K562細胞出現(xiàn)變形或核碎裂等形態(tài)變化。流式細胞術(shù)結(jié)合姬姆薩染色顯示，ASAP可濃度依賴性地引起K562細胞凋亡和G2/M期阻滯，其中ASAP 200 mg·L-1處理48 h，K562細胞早期凋亡率為（32.8±0.1）%〔對照組（3.7±1.1）%〕（P＜0.01），晚期凋亡率為（31.2±2.2）%〔對照組（9.9±0.8）%〕（P＜0.01）；G2/M期細胞為（55.2±1.7）%〔對照組（15.3±0.8）%〕（P＜0.01）。Western蛋白質(zhì)印跡法實驗結(jié)果顯示，ASAP作用0～40 h，K562細胞中胱天蛋白酶原3（32 h時）明顯下調(diào)（P＜0.01），胱天蛋白酶3表達明顯增加（P＜0.01），而隨著ASAP作用時間的延長，PDCD4和P53蛋白表達均下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論 誘導(dǎo)K562細胞凋亡和G2/M期阻滯可能是ASAP細胞毒作用的主要機制；ASAP誘導(dǎo)的細胞凋亡是胱天蛋白酶3通路依賴的，誘導(dǎo)K562細胞凋亡和G2/M期阻滯可能與PDCD4和P53蛋白表達下調(diào)相關(guān)。

毛蚶抗癌活性蛋白組分；K562細胞；細胞凋亡；細胞周期；胱天蛋白酶3

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.007

毛蚶（Arca subcrenata Lischke）為軟體動物門瓣鰓綱列齒目蚶科毛蚶屬生物，在中國、日本和朝鮮沿岸產(chǎn)量豐富。毛蚶殼為中藥瓦楞子的來源之一［1］，《本草綱目》記載瓦楞子能“消血塊，散痰積”，《醫(yī)林纂要·藥性》記載其能“攻堅破瘀”。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，毛蚶水提物對人結(jié)腸癌細胞HT-29、HCT-116、人肝癌細胞HepG-2、Bel-7402和人肺癌細胞A549生長具有明顯的抑制作用，均隨濃度增加和作用時間延長而抑制作用增強［2］。進一步對毛蚶水提物進行活性追蹤發(fā)現(xiàn)，毛蚶抗癌蛋白（Arca subcrenata Lischke anticancer protein，ASAP）活性組分為其主要活性部位。體外實驗表明，ASAP兼具細胞毒性和免疫激活雙重作用，對多種腫瘤細胞生長具有抑制作用［3］。

慢性粒細胞白血?。╟hronic granulocytic leukemia，CGL）又稱慢性髓細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML），因產(chǎn)生大量不成熟的白細胞，在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血，并且通過血液在全身擴散。由于來源不同，白血病細胞對抗腫瘤藥物的敏感性與上皮來源的腫瘤細胞有所不同。本研究選擇人CGL細胞K562細胞，探討ASAP的細胞毒作用及其可能的機制。

1　材料與方法

1.1細胞和其培養(yǎng)基

K562細胞為北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥實驗室凍存。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco BRL公司；胎牛血清購自杭州四季青公司。青霉素/鏈霉素雙抗購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑

去甲斑蝥素（norcantharidin，母液濃度10 g·L-1）、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT和姬姆薩（Giemsa）染料購自美國Sigma公司；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自中國凱基生物公司；BCA（bicinchoninic acid）蛋白測定試劑盒為美國Thermo scientific公司產(chǎn)品；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自美國Amresco公司；其他試劑均為市售分析純。胱天蛋白酶3一抗和P53一抗（鼠抗）購自美國Cell Signaling Technology公司，稀釋比例分別為1∶1000和1∶2000；二抗（山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，稀釋比例1∶2500；程序性細胞死亡因子4 （programmed cell death 4，PDCD4）一抗（兔抗）為美國肯塔基大學(xué)楊新盛博士惠贈，稀釋比例1∶1000；β肌動蛋白一抗（小鼠抗β肌動蛋白單抗）（稀釋比例1∶1000）和二抗（山羊抗小鼠IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記）（稀釋比例1：2500）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3主要儀器

倒置顯微鏡（TE 2000-S，日本Nikon公司），超低溫冰箱（MOF-U3386S，日本SANYO公司），恒溫培養(yǎng)箱〔MCO-18AIC（UV），日本SANYO公司〕，酶標(biāo)儀（130315A，美國Molecular Devices公司），流式細胞儀（BD FACSCantoⅡ，美國Beckman Coulter公司），細胞涂片離心機（TXD3，長沙湘儀離心機儀器有限公司），高速冷凍離心機（TGL-20M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司），純水儀（Milli-Q Biocel，Millipore公司），滲透壓儀（STY-1，天津天大天發(fā)科技有限公司），電子天平（PB303-S，北京Sartorius儀器有限公司）。

1.4細胞培養(yǎng)

K562細胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1的RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2和飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)，平均2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.5毛蚶及其抗癌活性蛋白組分的制備

毛蚶購自北京望京海鮮市場，產(chǎn)地為山東青島，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系孫震曉教授鑒定證實。依據(jù)參考文獻［3］中描述的方法，取同批次新鮮毛蚶（以200 g為例），在0.3%鹽水中吐砂，去殼，清洗后取毛蚶軟體加入適量超純水，制成勻漿。離心（4℃，12 000×g，20 min）取上清，緩慢加入硫酸銨至飽和度達到35%；磁力攪拌40 min，離心（4℃，12 000×g，20 min）收集上清，繼續(xù)加入硫酸銨使飽和度至70%；磁力攪拌40 min，離心（4℃，12 000×g，20 min），收集上清；繼續(xù)加入硫酸銨使飽和度達到100%時收集上清，溶于5 mL預(yù)冷的高純水中，透析24 h后，離心（4℃，12 000×g，20 min），0.22 μm孔徑濾膜過濾除菌，獲ASAP，分裝保存于-80℃。取凍干粉測定ASAP的蛋白含量。細胞實驗時取適量溶于RPMI 1640培養(yǎng)基，配成所需蛋白濃度。

1.6ASAP相對分子質(zhì)量范圍和蛋白含量測定

根據(jù)文獻［4］方法，采用SDS-PAGE電泳分析ASAP主要蛋白質(zhì)條帶及其相對分子質(zhì)量分布。ASAP凍干粉稱重，加適量超純水溶解配成ASAP溶液。Bradford法制標(biāo)準蛋白濃度曲線并計算ASAP濃度。根據(jù)ASAP濃度及凍干粉干重計算ASAP含量：ASAP含量（%）=ASAP濃度（g·L-1）× ASAP樣品體積（mL）/ASAP凍干粉凈重（mg）× 100%

1.7細胞形態(tài)觀察

對數(shù)生長期的K562細胞于6孔板培養(yǎng)24 h后離心棄舊培養(yǎng)液。將ASAP溶液（終濃度0，50，100 和200 mg·L-1）加入K562細胞中培養(yǎng)0～48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。另依據(jù)參考文獻［5］的方法，把處于對數(shù)生長期的K562細胞按每孔2×104個接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加ASAP（終濃度為50，100和200 mg·L-1）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集全細胞，用無菌PBS緩沖液按等體積重懸，涂片離心（1000×g，10 min），甲醇固定5 min，姬姆薩染色20 min，拍照記錄。

1.8MTT法測定細胞存活

根據(jù)文獻［6］方法，取對數(shù)生長期K562細胞接種于96孔板中，每孔2000細胞；培養(yǎng)24 h后加入ASAP溶液（終濃度為50，100和200 mg·L-1），以RPMI 1640完全培養(yǎng)基為細胞對照，去甲斑蝥素（終濃度10 mg·L-1）為陽性對照組；于37℃，5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)24～72 h，離心棄培養(yǎng)基，加入100 μL MTT工作液（終濃度500 mg·L-1），孵育4 h；棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀上550 nm波長處測吸光度（A550 nm）值。細胞存活抑制率（%）=（1-ASAP組A550 nm/細胞對照組A550 nm）× 100%。

1.9AnnexinⅤ/Pl雙染法檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的K562細胞接種于12孔板，每孔8×105細胞。培養(yǎng)24 h后加入ASAP（終濃度200 mg·L-1），處理48 h，分別收集細胞對照組和ASAP處理組全細胞，離心（4℃，2000×g，5 min）棄上清。加入預(yù)冷的PBS 1 mL，離心（4℃，2000×g，5 min）棄上清，重復(fù)2次。其余步驟按細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。上機前進行常規(guī)光路校準，然后進行檢測，用BD FACSDiva software v6.1.3軟件分析細胞凋亡。

1.10流式細胞術(shù)檢測細胞周期

細胞接種和藥物處理同上，ASAP作用48 h后收集全細胞，PBS洗1遍，70%冷乙醇重懸，4℃固定過夜；測定前離心（1000×g，10 min），除去固定液，PBS洗滌2次，適量預(yù)冷的50 mg·L-1RNA酶A。PBS重懸，孵育30 min，加入PI染液，4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測。上機前進行常規(guī)校準光路，ModFit LT軟件分析細胞周期。

1.11Western蛋白質(zhì)印跡法檢測胱天蛋白酶原3，胱天蛋白酶3，P53及PDCD4蛋白表達

依據(jù)參考文獻［7］方法進行樣品處理。處于對數(shù)生長期的K562細胞經(jīng)200 mg·L-1ASAP處理8，16，24，32和40 h，分別收集細胞對照組和處理組細胞，PBS清洗2次后加入細胞裂解液（Tris-HCl 50 μmol·L-1，pH 8.0；1%NP-40，NaCl 150 μmol·L-1；0.1%SDS，1%蛋白酶抑制劑Cocktail Set）破碎細胞，收集蛋白質(zhì)；BCA法測定蛋白質(zhì)樣品的濃度。蛋白上樣量為50 μg，進行SDS-PAGE（10%SDS），硝酸纖維素濾膜電轉(zhuǎn)1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加胱天蛋白酶3，PDCD4及P53一抗稀釋液（抗體稀釋比例分別為1∶1000，1∶1000和1∶2000），4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例1∶2500）室溫孵育2 h；β肌動蛋白抗體稀釋比例1∶1000；參照ECL試劑盒說明書進行ECL反應(yīng)，于暗室壓片曝光，掃描蛋白質(zhì)條帶，用Quantity One （Bio-Rad Laboratories，USA）軟件分析積分吸光度（integrated absorbance，IA），待測蛋白相對表達水平用IA待測蛋白/IAβ肌動蛋白比值表示。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1ASAP蛋白含量及相對分子質(zhì)量范圍

本研究制備的ASAP凍干粉蛋白含量為（79.95± 7.11）%。由SDS-PAGE電泳分析結(jié)果（圖1）可見，ASAP組成以＜30 ku的小分子蛋白質(zhì)為主。

Fig.1　Protein molecular mass range of A.subcrenata Lischke anticancer protein（ASAP）.

Fig.2 Effect of ASAP on K562 cell proliferation（A）and inhibition curve（B）.Cell inhibitory rate（%）=（1-A550nmof ASAP treated group/A550nmof control group）×100%.，n=3.**P＜0.01，compared with corresponding control group.

2.2ASAP對K562細胞的細胞毒作用

如圖2（A）所示，在24～72 h內(nèi)細胞對照組K562細胞存活呈指數(shù)增長趨勢，而ASAP組細胞存活曲線升高趨勢減弱，表明ASAP明顯抑制K562細胞存活。以ASAP濃度為橫坐標(biāo)，對K562細胞存活抑制率為縱坐標(biāo)繪制抑制率曲線（圖2B），可見作用24～72 h，ASAP對K562細胞存活的抑制作用呈濃度和時間依賴性，24，48和72 h的濃度-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.851（P＜0.01），0.8977（P＜0.01）和0.8997（P＜0.01）；ASAP 50，100，200，400和800 mg·L-1的時間-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.0195（P＜0.05），0.7043（P＜0.01），0.9359（P＜0.01），0.9735（P＜0.01）和0.9698（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of ASAP on morphological changes of K562 cells observed under inverted phase-contrast microscope.

2.3ASAP對K562細胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡下觀察（圖3），細胞對照組細胞數(shù)隨時間呈正常增加的趨勢，而各ASAP處理組隨著濃度和作用時間的增加，細胞數(shù)量明顯減少，且出現(xiàn)形態(tài)變化如變形和碎裂等。

姬姆薩染色發(fā)現(xiàn)，ASAP作用K562細胞48 h，細胞出現(xiàn)明顯的核碎裂和凋亡小體（圖4），推測ASAP可引起K562細胞發(fā)生G2/M期阻滯或細胞凋亡。

Fig.4　Effect of ASAP for 48 h on cell and nuclear morphological changes of K562 cells（Giemsa staining）.↑：nuclear fragmentation；▽：apoptosis.

2.4ASAP對K562細胞凋亡的誘導(dǎo)作用

ASAP 50，100和200 mg·L-1作用48 h后，K562細胞早期凋亡和晚期凋亡率明顯增加（圖5，表1）（P＜0.01），表明ASAP能誘導(dǎo)K562細胞凋亡。

Fig.5 Effect of ASAP for 48 h on K562 cell apoptosis determinted by flow cytometry.A：control group；B-D：ASAP 50，100 and 200 mg·L-1group，respectively.

Tab.1 Apoptosis rate of K562 cells induced by ASAP for 48 h

2.5ASAP對K562細胞周期的影響

由圖6和表2所示，ASAP 50，100和200 mg·L-1作用48 h，K562細胞G1和S期細胞比例減少，G2/M期細胞比例顯著增加（P＜0.01），發(fā)生明顯的G2/M期阻滯。

2.6ASAP對K562細胞胱天蛋白酶原3，胱天蛋白酶3，P53及PDCD蛋白表達的影響

如圖7所示，ASAP 200 mg·L-1作用于K562細胞0～40 h，隨著作用時間的延長，細胞中凋亡蛋白胱天蛋白酶原3（35 ku）（32 h時）呈明顯下調(diào)趨勢（P＜0.01），同時可檢測到凋亡蛋白胱天蛋白酶3（17 ku）的表達明顯增加（P＜0.01），說明ASAP誘導(dǎo)K562細胞凋亡與效應(yīng)蛋白胱天蛋白酶3的激活密切相關(guān)。

Fig.6 Effect of ASAP for 48 h on K562 cell cycle deter?minted by flow cytometry.A：control group；B-D：ASAP 50，100 and 200 mg·L-1groups，respectively.

Tab.2 Cell cycle changes of K562 cells induced by ASAP for 48 h

如圖8所示，ASAP 200 mg·L-1作用于K562細胞0～40 h，P53蛋白（53 ku）表達與對照組比較明顯下調(diào)（P＜0.01）。

Fig.7 Effect of ASAP 200 mg·L-1on expression of procaspase 3 and caspase 3 proteins in K562 cells detected by Western blotting.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.**P＜0.01，compared with control（0 h）group.

Fig.8 Effect of ASAP 200 mg·L-1on expression of P53 protein in K562 cells detected by Western blotting. B was the semi-quantitative result of A.，n=3.**P＜0.01，compared with control group.

如圖9所示，ASAP 200 mg·L-1作用于K562細胞0～40 h，隨著藥物作用時間的延長，PDCD4蛋白（52 ku）表達較對照組明顯下調(diào)（P＜0.01）。

Fig.9 Effect of ASAP 200 mg·L-1on expression of programmed cell death 4（PDCD4）protein in K562 cells detected by Western blotting.B was the semi-quan?titative result of A.，n=3.**P＜0.01，compared with control group.

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，ASAP 50～800 mg·L-1作用24～72 h，對K562細胞存活有明顯的抑制作用，部分細胞形態(tài)發(fā)生較明顯變化。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示，ASAP 50～200 mg·L-1作用于K562細胞48 h，隨著濃度增加，G1和S期細胞百分率明顯減少，G2/M期細胞和凋亡細胞比例明顯增加。

已知胱天蛋白酶是細胞凋亡通路上的關(guān)鍵酶之一，依賴胱天蛋白酶的細胞凋亡往往與35 ku的胱天蛋白酶原3斷裂產(chǎn)生有活性的17 ku左右的效應(yīng)分子胱天蛋白酶3有關(guān)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，ASAP 200 mg·L-1作用于K562細胞32 h，細胞胱天蛋白酶原3蛋白明顯下調(diào)，而其活性形式胱天蛋白酶3蛋白明顯上調(diào)，說明ASAP誘導(dǎo)K562細胞凋亡與胱天蛋白酶3依賴通路的激活有關(guān)。

抑癌基因蛋白PDCD4和P53的表達與細胞凋亡和細胞周期阻滯關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，ASAP可以下調(diào)PDCD4和P53蛋白的表達。有研究表明，PDCD4蛋白具有抑制蛋白翻譯的作用，可以抑制胱天蛋白酶原蛋白的表達，其表達下降可促進胱天蛋白酶依賴的細胞凋亡［8］。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物去甲斑蝥素在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡時PDCD4的表達明顯下調(diào)［9］，推測ASAP下調(diào)PDCD4表達與ASAP誘導(dǎo)K562細胞凋亡有關(guān)。已知抑癌基因p53突變與多種細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)展有關(guān)［10-13］，突變型p53不僅喪失了抑癌功能，還可以促進腫瘤細胞的增殖及阻斷細胞凋亡［14］，提示ASAP下調(diào)P53蛋白的表達對其誘導(dǎo)K562細胞凋亡和G2/M期阻滯有重要作用。

Hu等［15］比較了毛蚶提取物P2對7種癌細胞（HepG2，HeLa，HT-29，K562，B16-F10，DU145和SPC-A-1）的抗癌活性。結(jié)果表明，P2對HeLa和HT-29細胞作用明顯；體內(nèi)實驗對小鼠H22和S180的最高抑瘤率分別為46.4%和60.1%。本研究在前期ASAP體外抗腫瘤活性篩選的基礎(chǔ)上，證明其對人K562細胞具有明顯的周期阻滯作用和誘導(dǎo)凋亡作用。其體內(nèi)給藥對腫瘤的的抑制作用還有待進一步研究。

從毛蚶中分離活性蛋白單體已有報道。Song等［16］利用DEAE陰離子交換和Sephadex G50凝膠柱層析分離純化出了G-6和G-4-2兩個活性多肽，分子質(zhì)量分別為8.2和16.0 ku。其中G-6是糖肽，已通過氨基酸自動分析儀獲得了其氨基酸組成。體外實驗證實了G-4-2能抑制HeLa，HL-60和KB細胞的增殖。Chen等［17］利用陰離子柱層析和疏水柱層析分離得到抗腫瘤、抗氧化單體肽H3，相對分子質(zhì)量為20.5 ku，等電點為6.65，獲知了部分氨基酸序列，并證實其能在體外抑制多種腫瘤細胞增殖。上述研究為進一步獲取活性更好、純度更高的毛蚶抗癌蛋白奠定了基礎(chǔ)。有關(guān)ASAP中活性蛋白的進一步分離純化也在進行中。

［1］Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmaco?poeia of the People′s Republic of China，Vol.1（中華人民共和國藥典2010年版一部）［S］.Beijing：China Medical Science Press，2010，65.

［2］Feng T，Tian JX，Li ZM，Lin HY，Sun ZX.Studies on the antitumor activities of the water extract of Arca subcrenata Lischke［J］.Chin J Mar Drugs（中國海洋藥物），2013，32（3）：40-48.

［3］Fu Y，F(xiàn)eng T，Zhao Chen，Tian JX，Sun ZX.The antitumor activity of Arca subcrenata Lischke protein ［J］.Carcinog Teratog Mutag（癌變·畸變·突變），2014，6：412-418.

［4］Liu SC.Extraction and purification of polypeptides from Arca subcrenata and preliminary study of their anti-oxidative capacity and antitumor activity in vitro（毛蚶天然多肽提取純化及其體外抗氧化能力和抑制腫瘤活性的初步研究）［D］.Qingdao：Ocean University of China（中國海洋大學(xué)），2013.

［5］Li RJ，Hong XF，Ji YY，Sun ZX.Norcantharidin induced mitotic arrest and apoptosis in human ovarian cancer SK-OV-3 cells［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2013，27（2）：180-186.

［6］Li ZM，Wang M，Xu ZL，Geng D，Sun ZX.Different cytotoxic effects of hydroxycamptothecin on human lung cancer cells and human embryo lung fibroblast cells［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2014，28（3）：315-320.

［7］ Li ZM，Sun ZX.The effect and the synergistic mechanism of irinotecan combined with norcan?tharidin in human gastric cancer cell line BGC-823 ［J］.Prog Biochem Biophys（生物化學(xué)與生物物理進展），2015，42（2）：169-181.

［8］Eto K，Goto S，Nakashima W，Ura Y，Abe SI. Loss of programmed cell death 4 induces apoptosis by promoting the translation of procaspase 3 mRNA［J］.Cell Death Differ，2012，19（4）：573-581.

［9］Wu Y，Cao CM，Wang HQ，Li ZM，Sun ZX.Nor?cantharidin downregulates programmed cell death 4 expression in human gastric cancer cells［J］. Chin J Pharmacol Toxicol（中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2013，27（4）：622-628.

［10］Sun LM，Wang LJ，Song M，Song JY.Expressions of mutated p53 and tumor suppressor gene PTEN in breast cancer［J］.Chin J Cancer Prev Treat（中華腫瘤防治雜志），2008，15（6）：430-433.

［11］Bian C，Li Z，Xu Y，Wang J，Xu L，Shen H.Clinical significance of mutant p53 protein expression in lung adenocarcinoma［J］.Chin J Lung Cancer（中國肺癌雜志），2015，18（1）：23-28.

［12］Duan W，Gao L，Jin D，Otterson GA，Villalona-Calero MA.Lung specific expression of a human mutant p53 affects cell proliferation in transgenic mice［J］. Transgenic Res，2008，17（3）：355-366.

［13］Liu YY.Resuscitating wild-type p53 expression by disrupting ceramide glycosylation：a novel approach to target mutant p53 tumors［J］.Cancer Res，2011，71（20）：6295-6299.

［14］Hong B，Van Den Heuvel AP，Prabhu VV，Zhang S，El-Deiry WS.Targeting tumor suppressor p53 for cancer therapy：strategies，challenges and oppor?tunities［J］.Curr Drug Targets，2014，15（1）：80-89.

［15］Hu X，Song L，Huang L，Zheng Q，Yu R.Antitumor effect of a polypeptide fraction from Arca subcrenata in vitro and in vivo［J］.Mar Drugs，2012，10（12）：2782-2794.

［16］Song L，Ren S，Yu R，Yan C，Li T，Zhao Y. Purification，characterization and in vitro anti-tumoractivity of proteins from Arca subcrenata Lischke ［J］.Mar Drugs，2008，6（3）：418-430.

［17］Chen L，Song L，Li T，Zhu J，Xu J，Zheng Q，et al. A new antiproliferative and antioxidant peptide isolated from Arca subcrenata［J］.Mar Drugs，2013，11（6）：1800-1814.

Effect of Arca subcrenata Lischke anticancer protein on cell proliferation and apoptosis of human myeloid leukemia K562 cells

ZHAO Chen1，F(xiàn)U Ying1，LIN Hua-ying2，SUN Zhen-xiao1
（1.College of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2.College of Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

OBJECTlVE To investigate the cytotoxic activity of Arca subcrenata Lischke anticancer protein（ASAP）constituents on human myeloid leukemia K562 cells in vitro and analyze its anticancer mechanisms.METHODSASAP was extracted by low temperature water and ammonium sulfate precipitation.Protein concentration of ASAP was detected by Bradford method.Morphological changes of cultured K562 cells treated with ASAP were observed under the inverted phase-contrast micro?scope.The cell and nucleus changes were analyzed by Giemsa staining.The cytotoxicity of ASAP on K562 cells was detected by MTT assay.Flow cytometry was used to detect apoptosis and cell cycle of K562 cells treated with ASAP.The expression of apoptosis and cell cycle related proteins procaspase 3，caspase 3，P53 and programmed cell death 4（PDCD4）were analyzed by Western blotting.RESULTS ASAP exhibited significant cytotoxic effect on K562 cells in a time-and concentration-dependent manner. The concentration-effect correlation coefficient of ASAP 50，100 and 200 mg·L-1on K562 cells for 24，48 and 72 h was 0.851，0.8977 and 0.8997，respectively.Under an optical microscope，K562 cells showed cytomorphosis，or nuclear fragmentation after treatment with ASAP 200 mg·L-1for 48 h.Flow cytometry analysis and Giemsa staining assay indicated that apoptotic cells increased and G2/M phase cells accumulated significantly with the increase of ASAP concentration.After treatment with ASAP 200 mg·L-1for 48 h，the early and late apoptosis cell rate increased to（32.8±0.1）%and（31.2±2.2）% vs control group（3.7±1.1）%and（9.9±0.8）%（P＜0.01），respectively，and the G2/M phase cells increased to（55.2±1.7）%vs（15.3±0.8）%in control group（P＜0.01）.After treatment with ASAP 200 mg·L-1for 0-40 h，the expression of apoptotic protein procaspase 3 was down-regulated and its active form caspase 3 was significantly up-regulated at 32 h，while PDCD4 and P53 protein expression was down-regulated significantly in 0-40 h.CONCLUSlON Apoptosis and cell cycle arrest induced in G2/M phase may account for ASAP cytotoxic activity to K562 cells.K562 cell apoptosis induced by ASAP depends on caspase 3 signal pathway.Down-regulated expression of PDCD4 and P53 proteins may be related to K562 cell apoptosis and cell cycle arrest in G2/M phase by ASAP.

Arca subcrenata anticancer protein；K562 cells；apoptosis；cell cycle；caspase 3

SUN Zhen-xiao，E-mail：sunzx@bucm.edu.cn，Tel：（010）84738646

R285.5，R979.1

A

1000-3002-（2016）03-0221-08

2015-10-27接受日期：2016-01-28）

（本文編輯：齊春會）

趙 晨，女，碩士研究生，主要從事天然藥物抗癌活性成分篩選和藥理學(xué)研究，E-mail：reko33@sina.com，Tel：13661122026

孫震曉，E-mail：sunzx@bucm.edu.cn，Tel：（010）84738646