王建霞，符麗娟（遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121000）

WANG Jian-xia，F(xiàn)U Li-juan（Department of Pharmacology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China）

曲尼司特對(duì)高糖培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響

王建霞，符麗娟
（遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121000）

目的 探討曲尼司特對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的作用及可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞（CF）分為正常對(duì)照組（5.5 mmol·L-1葡萄糖）、高滲對(duì)照組（葡萄糖5.5 mmol·L-1+甘露醇25 mmol·L-1）、高糖組（25 mmol·L-1葡萄糖）、曲尼司特干預(yù)組（葡萄糖25 mmol·L-1+曲尼司特50，100和200 μmol·L-1）及活化素受體樣激酶7（ALK7）阻斷劑組（葡萄糖25 mmol·L-1+SB431542 10 μmol·L-1）。各組細(xì)胞分別與不同藥物孵育48 h后，采用MTT法檢測(cè)CF存活，免疫熒光法檢測(cè)CF表型轉(zhuǎn)化，Western蛋白印跡法檢測(cè)CF特異性蛋白1（FSP-1）、α平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）和ALK7的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，高糖組CF A492 nm明顯升高（P＜0.01），F(xiàn)SP-1表達(dá)明顯減少（P＜0.01），α-SMA表達(dá)明顯增多（P＜0.01），TGF-β1和ALK7表達(dá)增多（P＜0.01），而高滲對(duì)照組以上指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。與高糖組比較，應(yīng)用ALK7阻斷劑SB431542及不同濃度曲尼司特同步干預(yù)后，均可使CF A492 nm顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)SP-1表達(dá)明顯增多（P＜0.05），α-SMA表達(dá)明顯減少（P＜0.01），TGF-β1表達(dá)明顯減少（P＜0.05），ALK7表達(dá)減少（P＜0.05）。結(jié)論 曲尼司特可抑制高糖誘導(dǎo)的CF增殖及表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與下調(diào)ALK7的表達(dá)有關(guān)。

曲尼司特；高糖；心肌成纖維細(xì)胞；活化素受體樣激酶7

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.004

糖尿病性心肌病是糖尿病患者主要的并發(fā)癥之一，心肌纖維化是其主要病變，其中心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblast，CF）過(guò)度增殖、表型轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的分泌失衡是其主要病理基礎(chǔ)。研究表明，高糖刺激后CF出現(xiàn)細(xì)胞增殖，可轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的肌成纖維細(xì)胞［1］。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是CF表型轉(zhuǎn)化、遷移、增殖及合成ECM的關(guān)鍵因子。TGF-β對(duì)有絲分裂的影響是間接的，其誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖可能與TGF-β誘導(dǎo)下游一些基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。活化素受體樣激酶7 （activin receptor-like kinase 7，ALK7）是TGF-β超家族中絲/蘇氨酸激酶Ⅰ型受體的一種，通過(guò)與配體結(jié)合介導(dǎo)TGF-β/Smad信號(hào)通路［2］。研究表明，高糖可能促進(jìn)ALK7表達(dá)，然而其是否通過(guò)誘導(dǎo)ALK7表達(dá)從而促進(jìn)CF增殖及表型轉(zhuǎn)化報(bào)道較少［3］。曲尼司特是一種肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，最初作為抗過(guò)敏藥用于臨床，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌和腎有抗纖維化的作用［4-5］。本研究體外培養(yǎng)CF，觀察曲尼司特對(duì)高糖培養(yǎng)CF增殖、表型轉(zhuǎn)化以及ALK7蛋白表達(dá)的影響，以探討其抗纖維化作用及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品和試劑

1～3日齡的新生SD乳鼠，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（遼）2009-004。曲尼司特，國(guó)藥準(zhǔn)字H10930175，中國(guó)藥科大學(xué)制藥廠提供；ALK7阻斷劑SB431542，上海前塵生物科技公司。DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Medi?atech公司；特級(jí)胎牛血清、青鏈霉素和胰蛋白酶，天津森潤(rùn)生物公司；MTT試劑，中國(guó)Beyotime試劑公司；兔抗大鼠成纖維細(xì)胞特異性蛋白1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）抗體和小鼠抗大鼠ALK7單克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)公司；小鼠抗大鼠α-SMA抗體，博士德公司；TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗鼠熒光二抗和山羊血清工作液購(gòu)于中杉金橋生物有限公司；其他相關(guān)試劑均由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2CF制備、培養(yǎng)和鑒定

1～3日齡的新生SD乳鼠，在無(wú)菌條件下開(kāi)胸取出心臟，用冷PBS溶液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的組織塊，加入0.25%的胰酶，置于37℃水浴中搖動(dòng)離心管，至消化液稍混濁。棄去首次消化的上清液，將消化的上清液加至含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中終止消化，剩余組織繼續(xù)加入胰酶消化，將收集的細(xì)胞1000×g離心10 min，棄上清。將沉淀加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基吹打均勻后接種于底面積25 cm2培養(yǎng)瓶，送入通以體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及95%空氣的二氧化碳孵箱中。根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，差速貼壁90 min后，PBS沖洗細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)基［6］。細(xì)胞2 d換液1次，常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)近匯合狀態(tài)時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)用2～3代細(xì)胞。

1.3CF形態(tài)觀察和免疫學(xué)鑒定

將差速貼壁的CF接種到培養(yǎng)皿中進(jìn)行HE染色，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并照相。

應(yīng)用FSP-1抗體和α-SMA抗體免疫熒光染色進(jìn)行CF純度鑒定。取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞傳代至6孔板培養(yǎng)，觀察細(xì)胞覆蓋80%視野時(shí)，用PBS漂洗3次；用新鮮配置的4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次；0.3%Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3次；室溫下3%山羊血清封閉30 min；滴加FSP-1一抗或α-SMA一抗溶液，置于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜；PBS漂洗后，加入羅丹明或FITC標(biāo)記的二抗孵育1 h，PBS漂洗，封片，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。經(jīng)免疫熒光染色后只顯示紅色熒光、無(wú)綠色熒光的細(xì)胞表示FSP-1染色陽(yáng)性、α-SMA染色陰性，即判斷為CF，并計(jì)算CF純度。

1.4細(xì)胞分組和藥物處理

細(xì)胞傳代培養(yǎng)24 h后，換用無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物處理。鑒定后的CF分為以下7組：正常對(duì)照組，給予低糖DMEM培養(yǎng)液（含葡萄糖5.5 mmol·L-1）；高滲對(duì)照組，給予含甘露醇25 mmol·L-1的低糖DMEM培養(yǎng)液；高糖組，給予高糖DMEM培養(yǎng)液（含葡萄糖25 mmol·L-1）；3組曲尼司特干預(yù)組，分別給予含曲尼司特50，100 和200 μmol·L-1的高糖DMEM培養(yǎng)液；ALK7阻斷劑干預(yù)組，給予含SB431542 10 μmol·L-1的高糖DMEM培養(yǎng)液。各組細(xì)胞分別與含有不同藥物的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化后，用培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，以每孔300個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，每孔200 μL，貼壁培養(yǎng)24 h后吸去上清，加入不同條件培養(yǎng)基藥物處理48 h，每組設(shè)6復(fù)孔。每孔加入10 μL MTT（10 g·L-1）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清，每孔加DMSO 150 μL，搖床上避光振蕩10 min，使形成的甲瓚結(jié)晶物充分溶解，測(cè)定各孔吸光度A492 nm值。

1.6免疫熒光染色檢測(cè)FSP-1和α -SMA的表達(dá)

取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞傳代至6孔板培養(yǎng)，細(xì)胞覆蓋80%視野時(shí)血清饑餓24 h。加入不同條件培養(yǎng)基藥物處理48 h，用PBS洗3次。FSP-1和α-SMA免疫熒光染色方法同1.3。每組隨機(jī)選3個(gè)視野用Image pro plus圖像分析軟件分析，以積分吸光度（integrated absorbance，IA）與每孔總面積的比值表示FSP-1和α-SMA表達(dá)水平。

1.7Western蛋白印跡法檢測(cè)FSP-1，α -SMA，TGF-β1和ALK7蛋白表達(dá)水平

各組CF經(jīng)藥物處理48 h后，用冷PBS沖洗，立即放入預(yù)冷的裂解液中4℃超聲破碎勻漿，4℃12 000×g離心，取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將各組蛋白濃度調(diào)成一致。用10%～12%的SDS-PAGE凝膠電泳，每個(gè)泳道蛋白上樣量為20 μg，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，分別加入兔抗大鼠FSP-1一抗、小鼠抗大鼠α-SMA一抗、羊抗大鼠TGF-β1一抗和羊抗大鼠ALK7一抗，4℃孵育過(guò)夜，再與二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影后，用CAMIAS008圖像分析系統(tǒng)處理，蛋白表達(dá)水平用待測(cè)蛋白條帶與內(nèi)參蛋白β肌動(dòng)蛋白條帶IA的比值表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1CF形態(tài)和免疫學(xué)鑒定

本研究制備的細(xì)胞經(jīng)正常培養(yǎng)后，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞扁平鋪開(kāi)，呈梭形，細(xì)胞核比較大，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)常常有1～3個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞漿透明，折光弱，無(wú)自發(fā)搏動(dòng)。將差速貼壁細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中后進(jìn)行HE染色，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞清晰的形態(tài)。制備的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色后只顯示紅色熒光，無(wú)綠色熒光，提示FSP-1染色陽(yáng)性，α-SMA染色陰性。以上細(xì)胞形態(tài)和免疫學(xué)特點(diǎn)表明，本研究制備的細(xì)胞為CF，CF純度≥95%。

Fig.1　Morphological observation and identification of cardiac fibroblasts（CFs）（×100）.CFs were identified with immunofluorescence staining，fibroblast specific protein-1 （FSP-1）immune response was positive and α-smooth muscle actin（α-SMA）was negative.

2.2曲尼司特對(duì)高糖環(huán)境下CF活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高糖組CF A492 nm明顯升高（P＜0.01），而高滲對(duì)照組無(wú)明顯變化，提示高糖培養(yǎng)可促進(jìn)CF的存活。與高糖組相比，加入曲尼司特50，100和200 μmol·L-1干預(yù)后，對(duì)CF的存活具有顯著抑制作用；與高糖組相比，ALK7阻斷劑干預(yù)組CF A492 nm明顯降低（P＜0.05），提示ALK7可促進(jìn)CF的存活（圖2）。

Fig.2 Effect of tranilast on CFs proliferation incubated with high concentration of glucose by MTT assay.The CFs were incubated for 48 h.1：normal control group（glucose 5.5 mmol·L-1）；2：hypertonic group（glucose 5.5 mmol·L-1+mannitol 25 mmol·L-1）；3：high glucose group（glucose 25 mmol·L-1）；4，5 and 6：tranilast group（glucose 25 mmol·L-1+tranilast 50，100 and 200 μmol·L-1，respectively）；7：activin receptor-like kinase 7，（ALK7）inhibitor group（glucose 25 mmol·L-1+SB431542 10 μmol·L-1）.，n=6.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with high glucose group.

2.3曲尼司特對(duì)高糖培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞FSP-1和α-SMA表達(dá)的影響

免疫熒光分析結(jié)果（圖3，表1）顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞內(nèi)FSP-1蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01），α-SMA蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01），而高滲對(duì)照組無(wú)明顯變化，提示高糖培養(yǎng)環(huán)境可促進(jìn)CF表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，高滲組并無(wú)CF表型轉(zhuǎn)化。與高糖組比較，不同濃度曲尼司特干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)FSP-1蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.05），α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），提示曲尼司特可以抑制CF表型轉(zhuǎn)化。與高糖組比較，ALK7阻斷劑干預(yù)組FSP-1蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.05），α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），提示表型轉(zhuǎn)化與ALK7的表達(dá)有關(guān)。

Fig.3 Effect of tranilast on fibroblast specific protein-1 （FSP-1）and α -smooth muscle actin（α -SMA）expression of CFs incubated with high concentration of glucose （×100）.See Fig.2 for CF treatment.FSP-1 and α-SMA expression were detected by confocal laser scanning microscopy.

Tab.1 Effect of tranilast on FSP-1 and α -SMA expression of CFs incubated with high concentration of glucose

圖4結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)CF細(xì)胞FSP-1蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01），α-SMA蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01），高滲對(duì)照組無(wú)顯著性差異。與高糖組比較，曲尼司特50，100和200 μmol·L-1同步干預(yù)后，F(xiàn)SP-1蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.05），α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01），提示曲尼司特可抑制高糖誘導(dǎo)CF細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。與高糖組比較，ALK7阻斷劑干預(yù)組FSP-1蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.05），α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01），提示CF的表型轉(zhuǎn)化可能與ALK7表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

Fig.4 Effect of tranilast on FSP-1 and α -SMA expression of CFs incubated with high concentration of glucose.See Fig.2 for CF treatment.FSP-1 and α-SMA expression was detected by Western blotting.B was the semiquantitative result of A.1：normal control group；2：hypertonic group；3：high glucose group；4-6：high glucose+tranilast 50，100 and 200 μmol·L-1group，respectively；7：high glucose+ALK7 inhibitor group.，n=6.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with high glucose group.

2.4曲尼司特對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平的影響

圖5結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)CF細(xì)胞TGF-β1表達(dá)顯著增多（P＜0.01）；與高糖組比較，曲尼司特50，100和200 μmol·L-1同步干預(yù)后，TGF-β1表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。

2.5曲尼司特對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞ALK7表達(dá)水平的影響

圖6結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖組ALK7表達(dá)增多（P＜0.01）；與高糖組比較，曲尼司特50，100和200 μmol·L-1同步干預(yù)后ALK7表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of tranilast on transforming growth factor-β1（TGF-β1）expression of CFs incubated with high concen?tration of glucose.See Fig.2 for CF treatments.TGF-β1expression was detected by Western blotting.B was the semiquan?titative result of A.1：normal control group；2：high glucose group；3-5：high glucose+tranilast 50，100 and 200 μmol·L-1，respec?tively.，n=4.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with high glucose group.

Fig.6 Effect of tranilast on activin receptor-like kinase 7 （ALK7）expression of CFs incubated with high concen?tration of glucose.See Fig.2 for CF treatments.ALK7 expression was detected by Western blotting.B was the semi?quantitative result of A.1：normal control group；2：high glucose group；3-5：high glucose+tranilast 50，100 and 200 μmol·L-1，respectively.，n=4.**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with high glucose group.

3　討論

CF是心肌間充質(zhì)細(xì)胞的主要成員，其在心臟胚胎發(fā)育、結(jié)構(gòu)構(gòu)成及細(xì)胞間信號(hào)傳遞過(guò)程中起關(guān)鍵作用。生理情況下，可以通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及基質(zhì)金屬蛋白酶，維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的穩(wěn)態(tài)平衡。在病理狀態(tài)下，ECM合成增加和CF過(guò)度增殖可能將導(dǎo)致心肌纖維化。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，高糖是導(dǎo)致糖尿病心肌纖維化的主要因素［7］。高糖通過(guò)誘導(dǎo)氧自由基的生成及促進(jìn)ECM沉積，在糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，高糖可以誘導(dǎo)CF增殖和活化轉(zhuǎn)型，分化為肌成纖維細(xì)胞導(dǎo)致ECM沉積從而引起纖維化［8］。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖組CF明顯增殖。CF在高糖25 mmol·L-1條件下培養(yǎng)48 h后，F(xiàn)SP-1表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)升高，表明高糖培養(yǎng)CF出現(xiàn)增殖及表型轉(zhuǎn)化。

TGF-β1是致纖維化的關(guān)鍵因子，與多臟器間充質(zhì)纖維化有關(guān)。正常生理狀態(tài)下CF分泌TGF-β1含量很低，當(dāng)受到高糖、炎癥和氧化應(yīng)激等病理刺激時(shí)，TGF-β1表達(dá)上調(diào)，直接誘導(dǎo)CF轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞［9］。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖誘導(dǎo)TGF-β1表達(dá)增加；與高糖組比較，應(yīng)用不同濃度曲尼司特干預(yù)后TGF-β1表達(dá)降低，表明TGF-β1誘導(dǎo)CF表型轉(zhuǎn)化。

研究表明，TGF-β及其下游Smad蛋白參與了心肌纖維化的病理過(guò)程［10］。ALK7是TGF-β超家族Ⅰ型受體的一種。研究報(bào)道［11］，高糖可能促進(jìn)ALK7表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，機(jī)制可能是CF在受到高糖刺激后，TGF-β1分泌增多，激活A(yù)LK7與配體結(jié)合從而激活下游的Smad信號(hào)，促進(jìn)CF核基因的表達(dá)，使CF轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA，細(xì)胞增殖能力增加，其合成ECM的能力增加，心肌纖維化增加。本研究結(jié)果表明，與高糖組比較，ALK7阻斷劑SB431542組細(xì)胞增殖降低，表型轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)，提示CF增殖及表型轉(zhuǎn)化與ALK7表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

曲尼司特是一種肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，近年發(fā)現(xiàn)其有抗纖維化作用［12］。研究表明，曲尼司特可以明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用，可以通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路改善大鼠腎纖維化［13-14］。我們大量前期實(shí)驗(yàn)表明，曲尼司特可以通過(guò)降低TGF-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)改善糖尿病大鼠心肌纖維化［15］。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)CF增殖及表型轉(zhuǎn)化，TGF-β1分泌增加并能上調(diào)ALK7的表達(dá)；與高糖組比較，應(yīng)用ALK7阻斷劑SB431542和不同濃度曲尼司特同步干預(yù)后，F(xiàn)SP-1表達(dá)升高，α-SMA表達(dá)下降，TGF-β1分泌減少，ALK7表達(dá)減少，表明曲尼司特能抑制高糖培養(yǎng)CF增殖及表型轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與下調(diào)ALK7的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，高糖能誘導(dǎo)CF增殖及表型轉(zhuǎn)化；曲尼司特可以抑制CF表型轉(zhuǎn)化的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)ALK7的表達(dá)有關(guān)。

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Effect of tranilast on cardiac fibroblasts proliferation and phenotype transformation incubated with high concentration of glucose

OBJECTlVE To investigate the effect of tranilast on cardiac fibroblasts proliferation and phenotype transformation incubated with a high concentration of glucose and the possible mechanism. METHODS The cardiac fibroblasts were divided into seven groups in accordance with different nutrient solutions：normal control group（5.5 mmol·L-1glucose），hypertonic group（5.5 mmol·L-1glucose+ mannitol 25 mmol·L-1），high glucose group（25 mmol·L-1glucose），tranilast intervention groups （25 mmol·L-1glucose+tranilast 50，100 and 200 μmol·L-1），and activin receptor-like kinase 7（ALK7）inhibitor group（25 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SB431542）.The cell proliferation was detected by MTT method.The transformation of cardiac fibroblasts was determined by immunfluorescence staining.The expression of fibroblast specific protein 1（FSP-1），α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and ALK7 was assessed by Western blotting.RESULTS Compared with nor?mal control group，A492 nmof cells in high glucose group was significantly increased（P＜0.01），while the expression of α-SMA，TGF-β1and ALK7 protein in high glucose group was significantly increased（P＜0.01），but FSP-1 protein was significantly decreased（P＜0.01）.There was no difference between normal control group and hypertonic group.Compared with high glucose group，A492 nmof cells in tranilast or SB431542 intervention groups were decreased（P＜0.05），and the expression of α-SMA，TGF-β1and ALK7 protein was significantly decreased（P＜0.05），but the expression of FSP-1 protein was increased （P＜0.05）in tranilast or SB431542 intervention groups.CONCLUSlON Tranilast can inhibit the proliferation and phenotype transformation of cardiac fibroblasts induced by high glucose，which may be related to down-regulation of the expression of ALK7.

tranilast；high glucose；cardiac fibroblasts；activin receptor-like kinase 7

FU Li-juan，E-mail：lyflj2010@126.com

WANG Jian-xia，F(xiàn)U Li-juan
（Department of Pharmacology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China）

R966

A

1000-3002-（2016）03-0203-06

2015-07-13接受日期：2016-02-04）

（本文編輯：齊春會(huì)）

王建霞，女，碩士研究生，主要從事糖尿病并發(fā)癥藥理學(xué)研究；符麗娟，女，教授，主要從事糖尿病并發(fā)癥藥理學(xué)研究。

符麗娟，E-mail：lyflj2010@126.com