李云霞

（南昌大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科　江西 南昌　330006）

臍帶間充質干細胞對皮膚創(chuàng)傷愈合影響的實驗研究

李云霞

（南昌大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)療美容科江西 南昌330006）

目的：探討臍帶間充質干細胞（MSCs）對皮膚創(chuàng)傷愈合影響的實驗研究。方法：在重度燒傷大鼠中抽取80例作為研究對象，從臍血內分離出MSCs，依據隨機數字法分為MSCs膠原凝膠組、單純MSCs組、膠原凝膠組和生理鹽水組各20例，對其進行GFP熒光檢測、FISH原位雜交檢驗、Western Blotting、Real-Time PCR檢驗創(chuàng)面組織內VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases基因與蛋白表達、血管生成情況。結果：相較于單純MSCs組、膠原凝膠組和生理鹽水組，MSCs膠原凝膠組皮膚愈合率最高（P＜0.05），且Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases基因與蛋白表達最強（均P＜0.05），MVD數量最多（P＜0.05）。結論：臍帶間充質干細胞應用于皮膚創(chuàng)傷移植，可促使創(chuàng)傷表面的新愈細胞修復和重建，提升創(chuàng)面愈合率，并改善創(chuàng)面愈合效果。

臍帶間充質干細胞；皮膚創(chuàng)傷；愈合時間

在皮膚大面積創(chuàng)傷、燒傷或者因一些疾病導致皮膚嚴重受損情況下，患者因自身皮膚組織較為匱乏，因而臨床上主要應用異體皮膚移植療法暫時維護患者創(chuàng)面上的微粒皮組織。但因微粒皮組織的自主修復時間較長，10～14d后異體皮可因機體排斥而脫落［1］，導致創(chuàng)面愈合結果較差，并出現(xiàn)瘢痕增生現(xiàn)象，嚴重影響美觀。近幾年來，經臨床研究發(fā)現(xiàn)中胚層間充質干細胞存在免疫調控功能、多向分化潛能和支持造血以及促植入功能，在組織、器官修復方面有積極治療作用。本研究對80例嚴重燒傷大鼠實施隨機分組對照研究，評估臍帶間充質干細胞對皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，現(xiàn)報道如下。

1　資料和方法

1.1一般資料：入選本組研究的80例重度燒傷大鼠均為動物中心提供，將其隨機分為MSCs膠原凝膠組、單純MSCs組、膠原凝膠組和生理鹽水組各20例。其中MSCs膠原凝膠組中雌鼠12例，雄鼠8例，平均周齡為（16.3±0.4）周，體質量是174～227g，平均體質量為（201.5±9.0）g；單純MSCs組中雌鼠10例，雄鼠10例，平均周齡為（16.5±0.3）周，體質量是177～229g，平均體質量為（201.6±8.8）g；膠原凝膠組中雌鼠11例，雄鼠9例，平均周齡為（16.5±0.3）周，體質量是174～222g，平均體質量為（201.6±8.7）g；生理鹽水組中雌鼠11例，雄鼠9例，平均周齡為（16.57±0.6）周，體質量是174～227g，平均體質量為（201.6±8.9）g；四組大鼠性別、周齡和體質量等資料兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），可進行對比。本組所用臍帶標本均為健康產婦的足月分娩健康新生兒臍帶，且新生兒家長均對此知情同意，其培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶則采購于美國Coming公司，骨誘導、胎牛血清、脂肪誘導等培養(yǎng)基則采購于Gibco公司，其余試劑則為國產。

1.2臍帶間充質干細胞分離和培養(yǎng)方法：將浸泡于DMEM培養(yǎng)液內的臍帶標本自超凈臺取出，沖洗干凈后切成1～2mm3的小段并于37℃條件下使用0.075%膠原酶II與0.125%胰酶配合，并分別進行30min消化處理。完成臍帶血的分解后給予過濾和離心處理，在使用PBS持續(xù)沖洗兩次，并把離心后單個的核細胞接種在DMEM培養(yǎng)液內。棄掉未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至90%融合時，以胰蛋白酶予以消化和傳代培養(yǎng)。使用PKH26熒光染色實驗盒進行標記，并將標記過的3～5代有良好狀態(tài)的骨髓間充質干細胞與小牛皮中圖區(qū)的I型膠原相混合，在37℃狀態(tài)下孵育0.5h后，將MSCs予以無血清培養(yǎng)，2d后移入氣液面予以器官培養(yǎng)，2d后獲得含MSCs的MSCs凝膠。

1.3皮膚創(chuàng)傷表面治療方法：將大鼠進行麻醉、消毒處理。生理鹽水組大鼠僅應用生理鹽水清洗治療；單純MSCs組則予以3次生理鹽水清洗，并給予麻醉藥物注射處理。沿大鼠背部兩側燒傷創(chuàng)面皮膚到深處肌筋膜，將全層皮膚切除，并給予止血處理。取MSCs懸液1ml滴在創(chuàng)面上，保證其完全覆蓋皮膚創(chuàng)面，使用兩層紗布、透氣膠帶妥善包扎創(chuàng)面，底層使用無菌凡士林紗布，上層應用普通紗布。4h后將包扎拆除，再重新覆蓋上1層無菌紗布，持續(xù)滴入MSCs上清液；膠原凝膠組大鼠、MSCs膠原凝膠組分別應用膠原凝膠、MSCs膠原凝膠治療，操作過程和單純MSCs組相同。

1.4觀察指標：①評估兩組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率，其中愈合標準如下：創(chuàng)面無疼痛、結痂和滲出以及瘙癢等現(xiàn)象，僅存在色素沉著；②病理檢測：GFP熒光檢測、FISH原位雜交檢驗、Western Blotting、Real-Time PCR檢驗創(chuàng)面組織內VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases基因與蛋白表達、血管生成情況，其檢驗操作均嚴格依據試劑盒進行。

1.5統(tǒng)計學方法：本組所有數據資料均應用SPSS17.0軟件分析。計數資料采用例數（n）表示，其組間率（%）對比則采用χ2檢驗分析；正態(tài)計量資料以±s表示，兩組正態(tài)計量資料對比采取t檢驗；P＜0.05表示數據對比有統(tǒng)計學差異。

2　結果

2.1對比兩組大鼠的皮膚創(chuàng)面愈合率：MSCs膠原凝膠組、單純MSCs組、膠原凝膠組和生理鹽水組皮膚愈合率分別是95.05%、80.0%、70.0%、45.0%，其中MSCs膠原凝膠組皮膚愈合率最高（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠的皮膚創(chuàng)面愈合率對比　?。╪=20，例）

2.2對比四組大鼠創(chuàng)面組織內Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases蛋白表達：相較于膠原凝膠組、單純MSCs、生理鹽水組，MSCs膠原凝膠組Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2蛋白表達水平最強（P＜0.05），見表2。

表2　各組大鼠治療后Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白表達水平 （±s）

表2　各組大鼠治療后Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白表達水平 （±s）

組別　　　　　　　Ang-1　　　　　Ang-2　　Tie-2膠原凝膠組　　185±5 184±4　　180±5 MSCs膠原凝膠組　　168±4 149±1　　189±3單純MSCs　　　　　　　177±3 179±4　　173±4生理鹽水組　　　194±6 195±5　　191±3

2.3對比四組大鼠創(chuàng)面組織內Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases基因表達：相較于膠原凝膠組、單純MSCs、生理鹽水組，MSCs膠原凝膠組Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2基因表達最強（P＜0.05），見表3。

表3　各組大鼠治療后Ang-1、Ang-2、Tie-2基因蛋白表達水平（±s）

表3　各組大鼠治療后Ang-1、Ang-2、Tie-2基因蛋白表達水平（±s）

組別　　　　　　　Ang-1　　　　　Ang-2　　Tie-2膠原凝膠組　　184±3 192±2　　170±3 MSCs膠原凝膠組　　151±3 130±1　　158±3單純MSCs　　　　　　　164±3 157±4　　168±4生理鹽水組　　191±6 213±6　　185±3

2.4對比四組大鼠創(chuàng)面組織內Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases基因表達和微血管密度（MVD）關系：相較于膠原凝膠組、單純MSCs、生理鹽水組，MSCs膠原凝膠組Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2的（+）MVD數量最多（P＜0.05），見表4。

表4　各組大鼠治療后Ang-1、Ang-2、Tie-2基因和MVD關系

3　討論

目前，異體皮移植和自體微粒皮移植療法，是覆蓋皮膚創(chuàng)傷表面、修復患者大面積皮膚受損的最常見、最有效治療方法之一，但因上述治療過程需"種子"微粒皮緩慢生長和融合，容易因異體皮排斥、脫落，而未表皮化的皮膚創(chuàng)面又可能因異體皮的長期生長而被占位。期間的壞死異體皮可產生大量有害物質，甚至滋生細菌誘發(fā)感染［2］，對于患者機體帶來嚴重創(chuàng)傷。因此，如何促使患者皮膚創(chuàng)面微粒表皮生長，促使創(chuàng)面早期而快速的表皮化［4］，對于救治皮膚創(chuàng)傷患者有重要臨床意義。

伴隨醫(yī)學領域學者對于干細胞的研究飛速發(fā)展，人們對干細胞的特性也有了深入、全面認知［5］。干細胞治療技術逐漸成為國際醫(yī)學領域中最先進醫(yī)療技術之一。充質干細胞，是一種具備分化潛能、自我更新等多能干細胞，在成體上分布較為廣泛［6］，比如骨髓、胰腺、胚胎前提組織和臍帶血中［7］。據相關學者研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞可參與皮膚創(chuàng)面愈合過程，并促使遷延不愈的皮膚潰瘍快速愈合［8］。另外，已經有對燒傷患者應用間充質干細胞治療的報道，在深度燒傷患者創(chuàng)傷表面涂抹自體骨髓間充質干細胞懸液，可促使患者皮膚和血管再生［9］。臍帶血間充質干細胞還具備以下功能：①獨特免疫調節(jié)功能：免疫原性較低［10］，其在體外，能有效抑制混合淋巴細胞活性反應，在體內則能誘導機體免疫細胞耐受力［11］；多向分化潛能：一定誘導條件下，其可分化脂肪、成骨、肌腱、神經、肌肉、心肌、內皮、肝和韌帶等多類組織細胞［12］。通過長期的連續(xù)傳代培養(yǎng)液冷凍、培養(yǎng)，其多向分化潛能依然存在［13］；促植入和支持造血功能：其可分泌出多種細胞因子與細胞外基質［14］，并使其直接作用在細胞上，實現(xiàn)調控造血目的，最終促進機體造血干細胞的生長。依據臍帶血間充質干細胞上述特征［15］，其已經被廣泛應用在移植物抗遺傳性骨病、宿主病和骨髓移植等病癥治療中，發(fā)揮了其強大的組織、器官修復功能。

由本組試驗研究結果和病理學檢查結果可知，MSCs膠原凝膠組皮膚愈合率最高，Ang-1、Ang-2、Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases基因與蛋白表達最強，且MVD數量最多，證實了MSCs膠原凝膠改善創(chuàng)面愈合、減少瘢痕形成的作用。

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編輯/張惠娟

Experimental study on umbilical cord mesenchymal stemcells of the skin wound healing

LI Yun-xia
（Department of Medical Cosmetology， The Second Affliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006， Jiangxi， China）

ObjectiveDiscussion Experimental Study of umbilical cord mesenchymal stem cells （MSCs） on skin wound healing.MethodsExtraction in rats with severe burn 80 cases for the study， MSCs isolated from umbilical cord blood，according to randomized into MSCs collagen gel， pure MSCs group， collagen gel and saline group， 20 cases of which carried GFP fuorescence detection， FISH test in situ hybridization， Western Blotting， within the Real-Time PCR test wound tissue VEGF， Ang-1， Ang-2， Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases mRNA and protein expression， angiogenesis.ResultsPure MSCs group， collagen gel and saline groups， MSCs collagen gel skin healing rate was highest （P＜0.05）， and Ang-1， Ang-2， Tie-1and -2Receptor Tyrosine Kinases mRNA and protein compared to expression of the strongest （all P＜0.05）， maximum number of MVD （P＜0.05）.ConclusionUmbilical cord mesenchymal stem cells applied to the skin graft wound， can contribute to healing the wound surface of new cells to repair and rebuild， to enhance the rate of wound healing and improve wound healing effect.

umbilical cord mesenchymal stem cells； skin wound； healing time

Q813.1

A

1008-6455（2016）07-0051-03

江西省自然科學基金資助項目（20132BAB205050）

2016-02-02

2016-04-26