潘美云，鄒艷君，李帆帆，林　勉，麻淑磊*

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·藥學研究·

響應面優(yōu)化丹參飲水提液殼聚糖絮凝純化工藝

潘美云1，鄒艷君2，李帆帆1，林勉2，麻淑磊2*

目的利用響應面設計法優(yōu)化殼聚糖絮凝純化丹參飲水提液工藝。方法在單因素研究的基礎(chǔ)上，以液料比、殼聚糖加入量、絮凝溫度和絮凝時間為考察因素，以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率綜合評分為評價指標，使用Box-Behnken設計實驗方案，借助Design Expert 8.0.6b試驗設計軟件繪制響應面曲線圖，優(yōu)選最佳絮凝工藝。結(jié)果確定最佳絮凝工藝為液料比10.7 mL/g，殼聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝溫度51 ℃條件下處理1 h。結(jié)論響應面法優(yōu)化殼聚糖絮凝純化工藝穩(wěn)定可行，除雜率高，有效成分損失量少。

丹參飲；響應面；殼聚糖；絮凝純化

0　引言

丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁3味藥組成。其中丹參為君，化瘀止痛而不傷氣血；檀香、砂仁為臣藥，檀香辛溫調(diào)氣、和胃通絡，砂仁行氣調(diào)胃解郁，三藥合用，共奏活血行滯、解郁鎮(zhèn)痛之功。丹參飲在臨床上應用廣泛，可治療多種病癥，廣泛用于冠心病[1-2]、慢性胃炎[3-4]、消化性潰瘍[5-8]、心血管疾病[9]、腎功能衰竭[10]等的治療。

2009年四川省藥品食品監(jiān)督管理局制定的《四川省醫(yī)療機構(gòu)制劑研究技術(shù)要求》中古代經(jīng)典名方目錄(第一批)已將丹參飲收錄其中，蒲清榮等[11]通過薄層鑒別法、紫外-可見分光光度法測定丹參飲口服液，并初步建立其質(zhì)控標準。

口服液的制備中，對水提液的純化除雜比較困難。本研究選擇殼聚糖為絮凝劑，首先對藥液的液料比、殼聚糖加入量、絮凝溫度和絮凝時間進行單因素考察，再用響應面法優(yōu)化篩選各因素，并以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率的綜合評分為評價指標。方中丹參為君藥，丹酚酸B是其主要的活性成分，本研究將其作為含量分析的指標，權(quán)重系數(shù)為40%；透光率反映絮凝純化的程度，權(quán)重系數(shù)為30%；固含物整體反映藥液中物質(zhì)成分的比重，權(quán)重系數(shù)為30%。綜合得分=(透光率/最大透光率)×100×30%+(固含物保留率/最大固含物保留率)×100×30%+(丹酚酸B保留率/最大丹酚酸B保留率)×100×40%。

1　儀器和試藥

高效液相色譜儀DIONEX U3000 (美國賽默飛世爾科技有限公司)，超純水儀Synergy UV system (法國millipore)，智能溶出儀 RC806(天津天大天發(fā)科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 RV10(上海人和儀器有限公司)，電子分析天平 XS-105[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]，電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG-9240A(上海一恒科技有限公司)，恒溫混勻儀MS-100(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器 KQ-500DB，高速臺式離心機 TDZ5-MS(湖南湘儀實驗儀器有限公司)，數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 DK-98-IIA(天津泰斯特儀器有限公司)。

丹參(產(chǎn)地：四川，批號：140301)，砂仁(產(chǎn)地：廣東，批號：140501)，檀香(產(chǎn)地：云南，批號：140501)購自溫州市華宇中藥飲片有限公司。丹酚酸B對照品(批號：11562-201009，含量：93.7%)購自中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖(浙江寧波華泰化工有限公司)；冰醋酸、甲醇、無水乙醇、磷酸為分析純；乙腈為色譜純。

2　方法與結(jié)果

2.1丹參飲水提液的制備采用《醫(yī)宗金鑒》的藥物配比，即丹參30 g、砂仁3 g、檀香3 g。取丹參300 g、砂仁30 g、檀香30 g加水3 000 mL浸泡1 h，于60 ℃減壓提取1 h，真空度0.07 MPa，提取2次，抽濾得提取液。

2.2殼聚糖溶液的制備取殼聚糖2 g，加入1%醋酸溶液100 mL，60 ℃水浴中攪拌均勻，使其溶解，配制成2%的殼聚糖溶液。

2.3絮凝過程取上述丹參飲水提液200 mL于智能溶出儀中，加入一定量2%殼聚糖溶液，攪拌使其混合均勻，設定溫度，于智能溶出儀中進行反應，結(jié)束后，離心取上清液。

2.4透光率測定取絮凝后的上清液適量，以蒸餾水為參比，在日本島津UV-2450型紫外分光光度計上對丹參飲水提液進行全波段掃描，波長范圍為200～800 nm，重復3次，取平均值，得284 nm處為最佳吸收波長。見圖1。在284 nm處測定吸光度，換算為透光率。換算公式：A=-lgT，其中A為吸光度，T為透光率。

圖1　丹參飲最大吸光度

2.5HPLC法測定丹酚酸B含量[12]

2.5.1色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)為流動相，檢測波長為286 nm，柱溫：20 ℃，流速：1.2 mL/min，進樣量10 μL。該色譜條件下，丹酚酸B得到很好的分離，結(jié)果見圖2。

2.5.2對照品溶液的制備精密稱取丹酚酸B對照品6.36 mg置于20 mL容量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，制成儲備液。根據(jù)下述實驗要求，將對照品溶液稀釋，濃度分別為114.0、68.4、34.2、17.1、13.7 μg/mL。2.5.3供試品溶液的制備稱取丹參飲干浸膏約0.1 g置于50 mL容量瓶，加80%甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理(功率140 W，頻率42 kHz) 30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖2　丹酚酸B及丹參樣品色譜圖

2.5.4線性關(guān)系考察分別精密吸取11.92、14.90、29.80、59.59、148.98 μg/mL的丹酚酸B對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標、丹酚酸B對照品進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=47.901 X-0.211 44 (R2=0.999 3)，結(jié)果顯示，丹酚酸B在0.119～1.490 μg內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，符合實驗要求。

2.5.5精密度考察取濃度為29.80 μg/mL的丹酚酸B對照品溶液，按上述色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，得RSD為0.51%(n=6)，表明精密度良好，符合實驗要求。

2.5.6加樣回收試驗稱取已知含量的丹參飲干浸膏樣品0.1 g于50 mL量瓶中，共6份，加入丹酚酸B對照品適量，按上述供試品制備方法及色譜條件制樣、測定，計算丹酚酸B平均回收率為97.1%，RSD為1.63%，結(jié)果表明，準確度符合實驗要求。

2.5.7穩(wěn)定性考察取丹參飲供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25、30 h進樣，測定丹酚酸B峰面積值，得RSD為1.25%，表明供試品溶液丹酚酸B在30 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8重復性考察稱取已知含量丹參飲干浸膏樣品0.1 g于50 mL量瓶中，共6份，按上述供試品溶液制備方法進行制備，精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，進行含量測定分析，得丹酚酸B含量平均值為1.53 mg/mL，RSD值為1.25%，重復性符合實驗要求。

2.6絮凝工藝單因素試驗優(yōu)選丹參飲水提液絮凝工藝的條件，進行藥液的液料比、殼聚糖加入量、絮凝溫度、絮凝時間單因素試驗，確定響應面優(yōu)化試驗各因素的水平。

2.6.1丹參飲水提液液料比對絮凝工藝的影響按“2.1.2”項下方法制備丹參飲水提液，減壓濃縮至水提液液料比為6、8、10、12、14 mL/g，按1.0 mL/g (殼聚糖溶液/生藥)比例分別加入殼聚糖溶液，于50 ℃條件下，攪拌處理1 h，靜置2 h，5 000 r/min離心20 min，取上清液。測定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，并結(jié)合權(quán)重系數(shù)計算綜合評分，各指標結(jié)果見圖3。

由圖3可見，絮凝液透光率在液料比為6 mL/g時最小，隨著液料比的改變，在液料比為10 mL/g時，絮凝液透光率最大，但隨著液料比的繼續(xù)改變，透光率又稍微減小。而固含物保留率在液料比為6 mL/g時最大，隨著液料比的改變，由于單位體積藥液與殼聚糖結(jié)合率逐漸增大，固含物保留率逐漸變?。坏し铀酈保留率隨著液料比的變化，在8 mL/g時最大，但并無顯著變化。在液料比為10 mL/g時，綜合評分最高，故選擇液料比為絮凝工藝的影響因素，水平分別為8、10、12 mL/g。

圖3　液料比對絮凝工藝的影響

2.6.2殼聚糖加入量對絮凝工藝的影響取液料比為10 mL/g的丹參飲水提液，分別加入比例為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/g(殼聚糖溶液/生藥)的2%殼聚糖溶液，于50 ℃條件下，攪拌處理1 h，靜置2 h，5 000 r/min離心20 min，取上清液。測定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，并結(jié)合權(quán)重系數(shù)計算綜合評分，見圖4。

圖4　殼聚糖加入量對絮凝工藝的影響

由圖4可見，在加入0.5 mL/g(殼聚糖溶液/生藥)2%殼聚糖溶液時，加入殼聚糖未能充分絮凝純化藥液，絮凝液透光率最小；隨著殼聚糖加入量的增加，透光率逐漸增大，在加入量為0.5 mL/g時透光率最大；然而隨著殼聚糖加入量繼續(xù)增加，透光率又慢慢變小，這可能因為藥液中過多的殼聚糖殘留減低了藥液的透光率。固含物保留率在殼聚糖加入量為0.5 mL/g時最大，隨著殼聚糖加入量的慢慢增加，藥液中雜質(zhì)充分與殼聚糖結(jié)合產(chǎn)生絮狀物質(zhì)，固含物保留率逐漸減小。而丹酚酸B保留率在殼聚糖加入量逐漸增加的過程中先增大后減小。在殼聚糖加入量為1.0 mL/g時，綜合評分最高，故選擇殼聚糖加入量為絮凝工藝的影響因素，水平分別為0.5、1.0、1.5 mL/g。

2.6.3絮凝溫度對絮凝工藝的影響取液料比為10 mL/g的丹參飲水提液，加入比例為1.0 mL/g(殼聚糖溶液/生藥)的2%殼聚糖溶液，分別于30、40、50、60、70 ℃條件下處理1 h，攪拌處理1 h，靜置2 h，5 000 r/min離心20 min，取上清液。測定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，并結(jié)合權(quán)重系數(shù)計算綜合評分，見圖5。

圖5　絮凝溫度對絮凝工藝的影響

由圖5可見，絮凝液透光率在絮凝溫度為30 ℃時，絮凝液透光率最小，原因是在30 ℃時，殼聚糖與藥液未能充分反應，藥液未充分絮凝純化。隨著絮凝溫度逐漸升高，透光率逐漸提高，在絮凝溫度為50 ℃時透光率最高；隨著絮凝溫度的繼續(xù)升高，透光率降低，原因是隨著溫度不斷升高，導致絮凝作用過快，絮狀沉淀細小或無法沉降，故透光率有所下降。固含物保留率在絮凝溫度為30 ℃時最高，可能是因為此時發(fā)生了充分絮凝純化作用，殼聚糖也殘留其中，固含物含量增加，同時，導致此溫度下丹酚酸B保留率較低。隨著溫度逐漸升高，藥液中雜質(zhì)與殼聚糖充分結(jié)合，產(chǎn)生絮狀物質(zhì)，固含物保留率逐漸降低。隨著殼聚糖加入量的逐漸增加，丹酚酸B保留率先增大后減小，在長時間的高溫處理下，丹酚酸B發(fā)生降解，故在70 ℃時，丹酚酸B保留率最低。在絮凝溫度為50 ℃時，綜合評分最高，故選擇絮凝溫度為絮凝工藝的影響因素，水平分別為40、50、60 ℃。

2.6.4絮凝時間對絮凝工藝的影響取液料比為10 mL/g的丹參飲水提液，加入比例為1.0 mL/g (殼聚糖溶液/生藥)的2%殼聚糖溶液，于50 ℃下處理0.5、1、1.5、2、2.5 h，分別測定透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率，結(jié)果見圖6。

由圖6可見，絮凝時間為0.5 h時，透光率最小，固含物保留率和丹酚酸B保留率最大。隨著絮凝時間的延長，透光率和丹酚酸B保留率略有增大，之后無顯著變化。綜合評分在絮凝時間為1 h時達到最大值。故絮凝時間在絮凝純化工藝中為非顯著性影響因素，對絮凝純化工藝試驗的絮凝時間為1 h。

圖6　絮凝時間對絮凝工藝的影響

2.7響應面優(yōu)化試驗設計、方案及結(jié)果分析

2.7.1響應面優(yōu)化試驗設計單因素考察結(jié)果表明，丹參飲水提液液料比、殼聚糖加入量和絮凝溫度是影響絮凝純化工藝較大的3個因素，故選擇液料比(X1)、殼聚糖加入量(X2)和絮凝溫度(X3)為自變量，以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率的綜合評分為響應值，設計3因素3水平共17個試驗點的響應面分析試驗。星點設計實驗因素、水平見表1。

表1　響應曲面因素與水平

2.7.2響應曲面法試驗方案及結(jié)果分析按照BBD的試驗方案進行3因素3水平共17個試驗點的響應面分析試驗，結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計以及響應值

注：綜合得分=(透光率/最大透光率)×100×30%+(固含物保留率/最大固含物保留率)×100×30%+(丹酚酸B保留率/最大丹酚酸B保留率)×100×40%。

應用Design-Expert 8.0.6b軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到透光率、固含物保留率、丹酚酸B保留率的綜合評分(Y)預測值對自變量液料比(X1)、殼聚糖加入量(X2)和絮凝溫度(X3)的二次多項回歸方程：Y=95.766+1.016 25 X1+1.963 75 X2+0.775 X3+0.985 X1X2-0.312 5 X1X3+0.697 5 X2X3-1.895 5 X12-3.090 5 X22-3.393 X32(R2=0.982 8)。對上述回歸模型進行方差分析。見表3。

采用ANOVA分析效應面的回歸參數(shù)。由表3可知模型是極顯著的(P<0.000 1)，回歸模型決定系數(shù)為0.982 8，說明該模型能夠解釋98.28%的變化，因此，可用此模型對殼聚糖絮凝純化工藝進行分析和預測。由表3中的各個P值可見，殼聚糖加入量(X1)、殼聚糖加入量二次項和絮凝溫度二次項有極顯著性差異(P<0.000 1)，液料比(X1)及其二次項(X12)也具有顯著性差異(P<0.005)，說明3個因素對殼聚糖絮凝純化工藝都有一定的影響。

表3　Box-Behnken試驗結(jié)果分析

2.8殼聚糖絮凝純化工藝的響應面優(yōu)化利用Design Expert 8.0.6b軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及其響應曲面見圖7～圖9。

圖7　液料比和殼聚糖加入量交互作用的響應面等高線和響應面立體圖

圖8　液料比和絮凝溫度交互作用的響應面等高線和響應面立體圖

根據(jù)二次多項式模型，繪制各考察指標綜合得分與各自變量間的等高線圖及三維效應面圖。據(jù)Box-Behnken設計模型分析得知，殼聚糖絮凝純化工藝的參數(shù)：液料比為10.72 mL/g，殼聚糖加入量為1.2 mL/g，絮凝溫度51.38 ℃，此時效應值綜合評分預測值96.38%?？紤]到實際生產(chǎn)情況，調(diào)整各因素條件，確定最佳的絮凝純化工藝條件：液料比10.7 mL/g，殼聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝溫度51 ℃。

2.9最佳工藝驗證為驗證該模型的可靠性，根據(jù)實際操作，將絮凝純化工藝參數(shù)修正為液料比10.7 mL/g，殼聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝溫度51 ℃，絮凝1 h。按優(yōu)選的工藝進行5次驗證試驗，各批次透光率平均值為74.02%、RSD值為3.85% (≤5.00%)，平均固含物保留率為80.17%、RSD為4.48% (≤5.00%)，平均丹酚酸B保留率81.02%、RSD為3.94% (≤5.00%)，說明優(yōu)化所得的絮凝純化工藝穩(wěn)定、可行。

3　討論

中藥水提及其純化除雜是各種劑型制備的前提。水提液殼聚糖絮凝純化法能使藥液中的蛋白質(zhì)、膠體、鞣質(zhì)等微粒有效絮凝沉降，實現(xiàn)分離純化的目的。殼聚糖作為絮凝劑，具有安全、無毒、穩(wěn)定的優(yōu)點，可用于中藥有效成分的分離純化過程。

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，合理篩選出藥液的液料比、殼聚糖加入量、絮凝溫度和絮凝時間4個因素的水平，并利用Design-Expert 8.0.6b 軟件設計試驗，以透光率、固含物保留率和丹酚酸B保留率綜合評分為評價指標，對液料比、殼聚糖加入量和絮凝溫度進行優(yōu)化篩選，得最佳的絮凝純化工藝條件：液料比10.7 mL/g，殼聚糖加入量1.2 mL/g，絮凝溫度51 ℃。

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Optimization of flocculation technology of water-extraction solution from Danshen Yin with chitosan by response surface method

PAN Mei-yun1,ZOU Yan-jun2,LI Fan-fan1,LIN Mian2,MA Shu-lei2*

(1.The First People′s Hospital of Wenling,Wenling 317500,China;2.Yongjia Hospital of TCM,Yongjia 325401,China)

ObjectiveTo optimize the flocculation technology of water-extraction solution from Danshen Yin with chitosan by response surface methodology.MethodsThe response surface model was designed by Design Expert 8.0.6b program,and the best formulation was optimized on the basis of single factor analysis,with solid-liquid ratio,chitosan amount,flocculation temperature and flocculation time as the detecting factors,and the light transmission,solid content and salvianolic acid B retention rates as the evaluating indicators.ResultsThe best flocculation conditions were as follows:solid-liquid ratio was 10.7 mL/g with chitosan amount of 1.2 mL/g,and the temperature and time of flocculation was 51 ℃ and 1 h.ConclusionThe flocculation clarification technology optimized by response surface method is feasible and stable with high rate of impurity removal and high retention rate of active ingredient.

Danshen Yin;Response surface;Chitosan;Flocculation

2016-01-03

1.溫嶺市第一人民醫(yī)院，浙江 溫嶺 317500；2.永嘉縣中醫(yī)醫(yī)院，浙江 永嘉 325401

永嘉縣科技發(fā)展計劃項目(2015306)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608022