宋萍萍，袁明勇*，蔣學(xué)華，鄭伶俐

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蒲公英眼用溫敏凝膠的制備

宋萍萍1，袁明勇1*，蔣學(xué)華2，鄭伶俐1

目的研究蒲公英眼用溫敏凝膠的制備工藝。方法以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、HPMC為混合凝膠基質(zhì)，以淚液稀釋前后的膠凝溫度為指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)蒲公英眼用溫敏凝膠的處方。結(jié)果該制劑在室溫條件下是自由流動(dòng)的液體，在生理?xiàng)l件下發(fā)生相變形成凝膠，符合眼用制劑的質(zhì)量要求；凝膠溶蝕控制藥物的釋放速率，二者均遵循零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)論蒲公英眼用溫敏凝膠的制備工藝簡(jiǎn)單、可行。

蒲公英；溫敏凝膠；均勻設(shè)計(jì)；膠凝溫度

0　引言

中藥材蒲公英具有清熱解毒的功效，可提高機(jī)體的免疫力，活血化瘀、抑菌抗炎[1-3]。本研究擬以蒲公英為主藥，制備眼用制劑，以緩解視疲勞綜合征。傳統(tǒng)滴眼液的滯留時(shí)間短、生物利用度低，普通凝膠劑分劑量不準(zhǔn)確，患者的順應(yīng)性差。原位凝膠可克服以上不足，其在常溫下為液體，以液體的形式滴入眼后發(fā)生相變，形成凝膠。其使用方便、滯留時(shí)間長(zhǎng)、釋藥性能好、患者順應(yīng)性好，其中，溫度敏感型原位凝膠是研究的熱點(diǎn)[4]。本文旨在以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、HPMC為混合凝膠基質(zhì)，以淚液稀釋前后的膠凝溫度為指標(biāo)，優(yōu)化處方配比，探討蒲公英眼用溫敏凝膠的制備工藝。

1　儀器與試藥

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器廠)，SMC30D型冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(天河醫(yī)療儀器有限公司)，PHS-4C 精密度酸度計(jì)(成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司)，KQ3200B 型超聲波清洗器(成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司)，SMC30D型冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(天河醫(yī)療儀器有限公司)，NDJ-1 Rotational Viscometer(成都有機(jī)硅研究中心)，Anke TGL-16C型高速電動(dòng)離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電子分析天平(Sartorius)。泊洛沙姆407(簡(jiǎn)稱(chēng)P407，湖北恒碩化工有限公司)，泊洛沙姆188(簡(jiǎn)稱(chēng)P188，BASF)，HPMC(成都西亞化工有限公司)，蒲公英提取物(批號(hào)：TY20080502，綠原酸含量不低于0.38 mg/g、咖啡酸含量不低于0.49 mg/g，西安天園生物制劑廠)，ZHWY-103B型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)。

2　方法與結(jié)果

2.1膠凝溫度的測(cè)定方法采用“攪拌子法”測(cè)定膠凝溫度：在固定規(guī)格的西林瓶(直徑23 mm，高6.5 mm)中裝入定量的凝膠基質(zhì)，將溫度計(jì)插入，使水銀球完全浸沒(méi)于溶液中，同時(shí)于西林瓶中放置固定尺寸(18 mm×6 mm)的攪拌子。將西林瓶置于低溫水浴中，調(diào)節(jié)并固定攪拌速率(100 r/min)，使水浴緩慢恒速(0.5 ℃/min)持續(xù)升溫。當(dāng)攪拌子停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)的溫度即為膠凝溫度。

2.2淚液稀釋后膠凝溫度的測(cè)定人工淚液的配制：碳酸氫鈉2.18 g、氯化鈉 6.78 g、氯化鉀 1.38 g、無(wú)水氯化鈣 0.064 g，溶解于1 000 mL 重蒸水中，即得。基質(zhì)：人工淚液(40∶7)混合后按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定其膠凝溫度[5]。

2.3蒲公英提取物儲(chǔ)備液的制備精密稱(chēng)取蒲公英提取物1.000 g，置于棕色容量瓶中，加入溶劑(含1%聚山梨酯-80的重蒸水)100 mL，超聲處理30 min，放冷補(bǔ)失重，過(guò)濾離心，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，稱(chēng)定體積，待用。

2.4蒲公英眼用溫敏凝膠的制備在磁力攪拌下，在定量重蒸水中加入聚山梨酯(得含1%聚山梨酯的溶劑)，放置過(guò)夜、除去氣泡得溶劑。精密稱(chēng)定蒲公英提取物，加入溶劑(蒲公英∶溶劑= 1.000 g∶100 mL)，超聲處理30 min，放冷補(bǔ)失重，離心，上清液微孔濾膜濾過(guò)，稱(chēng)定濾過(guò)液的體積。向?yàn)V液中加入尼泊金丙酯、亞硫酸氫鈉，磁力攪拌下，加入HPMC，溶脹溶解，4 ℃放置過(guò)夜。磁力攪拌下，向溶液中加入泊洛沙姆407、188，使其溶脹溶解，4 ℃放置過(guò)夜，即得。

2.5均勻設(shè)計(jì)法篩選蒲公英眼用溫敏凝膠的處方

2.5.1均勻設(shè)計(jì)表通過(guò)預(yù)試驗(yàn)及單因素考察可知，淚液稀釋前后的膠凝溫度隨著P407、HPMC濃度的升高而降低，隨著P188濃度的升高而增高，并設(shè)計(jì)3種因素的取值范圍：P407 18%～22%，P188 0.2%～2.3%，HPMC 0.2%～1.8%，采用“均勻設(shè)計(jì)法”[6-8]篩選蒲公英眼用凝膠的凝膠基質(zhì)處方，以P407、P188、HPMC的含量(w/v)為考察因素，每個(gè)因素9個(gè)水平，并選用U9(95)使用表安排實(shí)驗(yàn)。以淚液稀釋后的膠凝溫度為主要考察指標(biāo)，以淚液稀釋前的膠凝溫度為參考指標(biāo)。均勻設(shè)計(jì)表及結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.2模型擬合應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，分別以Tgel后、Tgel前對(duì)P407、P188、HPMC的含量進(jìn)行多元線性回歸。Tgel后=85.442-24.455 P407+23.348 P188-37.045 HPMC (R=0.929，F(xiàn)=10.507>F0.05,3.5=5.41，回歸方程很顯著)，Tgel前= 82.349-25.615 P407+33.054 P188-56.390 HPMC (R=0.945，F(xiàn)=13.932>F0.01,3.5=12.1，回歸方程高度顯著)。由方程知：P407、HPMC降低Tgel，P188升高Tgel，結(jié)果與預(yù)試驗(yàn)一致；將6組數(shù)據(jù)代入回歸方程所得的膠凝溫度與實(shí)測(cè)值很接近。

表1　均勻設(shè)計(jì)表及結(jié)果

注：*膠凝溫度超過(guò)50 ℃以上記為“—”

2.5.3處方驗(yàn)證按最佳處方(實(shí)驗(yàn)6組)制備3批樣品，測(cè)定其淚液稀釋前后的膠凝溫度(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示，其重現(xiàn)性良好，故確定凝膠基質(zhì)為：P407、P188、HPMC含量分別為20%、1.6%、1.2%。

表2　處方6的可重現(xiàn)性

2.6蒲公英眼用溫敏凝膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

2.6.1pH值、膠凝溫度、滲透壓、黏度的測(cè)定按照《中國(guó)藥典》眼用制劑的要求及溫敏凝膠的特性檢查pH值、膠凝溫度、滲透壓、黏度等，如表3、圖1所示，均符合要求。

表3　pH值、滲透壓、膠凝溫度測(cè)定結(jié)果

圖1　樣品黏度隨溫度變化的曲線

2.6.2含量測(cè)定精密稱(chēng)取對(duì)照品綠原酸、咖啡酸，加50%甲醇溶液配制成含綠原酸173.2 μg/mL、咖啡酸182.4 μg/mL的混合溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液；將儲(chǔ)備液稀釋成系列工作液，其中綠原酸的濃度分別為：3.464、2.598、1.732、0.866、0.433、0.217、0.108 μg/mL；咖啡酸的濃度分別為：3.648、2.736、1.824、0.912、0.456、0.228、0.114 μg/mL[9]。

取0.3 mL 蒲公英眼用溫敏凝膠于離心管中，加入0.9 mL注射用水稀釋?zhuān)駬u混勻，即得供試品測(cè)定液。

按處方中其他輔料配制不含蒲公英的空白溫敏凝膠，按供試液的方法處理，即得陰性樣品溶液。

色譜條件：Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(17∶83)，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：30 μL，理論板數(shù)：按咖啡酸的峰計(jì)算應(yīng)不低于2.5×103(綠原酸峰不低于2.0×103)。陰性樣品、綠原酸/咖啡酸對(duì)照品及蒲公英眼用溫敏凝膠的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2　色譜圖

以系列工作液的峰面積對(duì)濃度作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y綠原酸=31 957 X-498.57 (r=0.999 8，n=7)，在0.108～3.464 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；Y咖啡酸=69 869 X-182.63 (r=0.999 9，n=7)，在0.11～3.648 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：綠原酸、咖啡酸含量的RSD(n=6)分別為1.17%、0.9%。

精密度試驗(yàn)：綠原酸、咖啡酸含量的RSD(n=6)分別為1.47%、1.19%；重復(fù)性試驗(yàn)：綠原酸、咖啡酸含量的RSD(n=6)分別為0.8%、1.3%；加樣回收試驗(yàn)：綠原酸、咖啡酸高、中、低濃度的總平均回收率RSD(n=9)分別為99.68%、98.66%。含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　樣品含量測(cè)定

2.6.3體外釋放行為的考察采用“無(wú)膜溶出模型”[10-12]考察綠原酸、咖啡酸的體外釋放及凝膠溶蝕情況。方法：取凝膠制劑約3 g于一定規(guī)格的西林瓶中，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器(固定振蕩頻率100 r/min、釋放溫度34 ℃)，預(yù)熱10 min，加入人工淚液 2 mL，震蕩20 min，傾出釋放介質(zhì)，稱(chēng)重，并記錄；再次預(yù)熱10 min，補(bǔ)人工淚液2 mL……，如此反復(fù)操作，直到剩余凝膠重量不足10%。釋放介質(zhì)，經(jīng)稀釋處理后，按“2.6.2”項(xiàng)下HPLC法測(cè)定目標(biāo)成分含量(人工淚液不影響綠原酸、咖啡酸含量的測(cè)定)，如上法連續(xù)測(cè)定同批制備的3份樣品。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸的釋放行為及凝膠溶蝕均遵循零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。綠原酸的釋放曲線：Q=0.006 1 t-0.004 5 (r=0.999 6)；咖啡酸的釋放曲線：Q=0.002 9 t+0.045 4 (r=0.999 1)；凝膠溶蝕曲線：Y=0.606 4 t-0.202 5 (r=0.999 3)。采用線性回歸分析獲得凝膠溶蝕與綠原酸、咖啡酸釋放的相關(guān)性曲線：Y=0.734 1 X+4.615 4 (r=0.999 7)、Y=0.478 9 X+4.648 2 (r=0.999 0)，線性關(guān)系均良好(r>0.999 0)，表明藥物釋放與凝膠溶蝕具有相關(guān)性，表明凝膠溶蝕是控制藥物釋放的主要因素。

3　討論

目前國(guó)內(nèi)上市的蒲公英制劑主要有片劑、膠囊劑、固體顆粒、沖劑、注射液等，眼用制劑尚未上市。本文研制了蒲公英眼用溫敏凝膠劑，以緩解視疲勞綜合征，為蒲公英眼用新劑型與新用途的開(kāi)發(fā)提供了部分試驗(yàn)依據(jù)，具有一定的創(chuàng)新性。本文研制的混合凝膠基質(zhì)同時(shí)具有原位凝膠及生物黏附劑的雙重優(yōu)勢(shì)，具有通用性，為制備溫敏型原位凝膠提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

滅菌方法的選擇及眼部刺激性考察是下一步重點(diǎn)考察的內(nèi)容。由穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)可知，該品遇熱、光均不穩(wěn)定，故通常的滅菌方法，如流通蒸汽滅菌法、熱壓滅菌法、紫外線滅菌法等均不適用。本品中含有高分子材料，制劑較黏稠，不能采用0.45、0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌法，故考慮采用輻射滅菌法，滅菌效果及滅菌后本品的質(zhì)量是否變化有待進(jìn)一步研究。

眼用藥物的安全性首先需要評(píng)價(jià)眼部的刺激性，而此項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)于各類(lèi)眼用藥物的研發(fā)是必不可少的。

體外釋放行為結(jié)果顯示，凝膠溶蝕速率>綠原酸釋放速率>咖啡酸釋放速率，推測(cè)其主要由綠原酸、咖啡酸、泊洛沙姆的結(jié)構(gòu)造成，三者的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。凝膠溶蝕的同時(shí)，只有未發(fā)生鍵合作用的自由態(tài)的綠原酸、咖啡酸隨之釋放出來(lái)，才可用HPLC測(cè)定其釋放量。綠原酸分子結(jié)構(gòu)大且較易形成分子內(nèi)氫鍵，相比之下，咖啡酸更易與泊洛沙姆分子結(jié)合，而導(dǎo)致其釋放速率慢于綠原酸。

圖3　咖啡酸(A)、綠原酸(B)、泊洛沙姆(C)結(jié)構(gòu)式

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Preparation of dandelion ophthalmic thermosensitive gel

SONG Ping-ping1,YUAN Ming-yong1*,JIANG Xue-hua2,ZHENG Ling-li1

(1.Department of Pharmacy,First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

ObjectiveTo study the preparation of the dandelion ophthalmic thermosensitive gel.MethodsThe ophthalmic gel was prepared with poloxamer 407/188 and HPMC,and the gelation temperature before and after tear dilution was employed as the index.The prescriptions were designed by uniformity design method.ResultsThe optimized formulation was a freely flowing liquid at room temperature and converted to a firm gel under physiological condition,and it was accorded with the requirement for ophthalmic application.Theinvitrorelease experiment showed that the release of drug from polo xamer gels followed zero-order kinetics.ConclusionThe preparation process of the dandelion ophthalmic thermosensitive gel is simple and feasible.

Dandelion;Thermosensitive gel;Uniform design;Gelation temperature

2015-12-09

1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，成都 610500；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都 610041

10.14053/j.cnki.ppcr.201608023