張會(huì)瑞，焦軍東

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lncRNA TP73-AS1對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG-2凋亡的影響及其機(jī)制

張會(huì)瑞，焦軍東*

目的探討肝癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA TP73-AS1差異表達(dá)，及其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響與作用機(jī)制。方法從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載并處理新一代測(cè)序(RNASEQ)數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法獲取顯著的肝癌相關(guān)lncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。將差異表達(dá)lncRNA映射入上述網(wǎng)絡(luò)中，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)肝癌相關(guān)lncRNA及其功能。通過MTT、AO/EB、Western blot方法對(duì)其功能學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果共識(shí)別25 439對(duì)顯著的lncRNA-gene共表達(dá)關(guān)系。在22個(gè)差異的lncRNAs被映射中，TP73-AS1度最高，該lncRNA的62個(gè)互作基因映射到病毒致癌作用(Viral carcinogenesis pathway)通路中，并能影響下游MAPK信號(hào)通路與p53信號(hào)通路。lncRNA TP73-AS1-siRNA影響HepG-2細(xì)胞增殖，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，增加Caspase-3活性，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，使p53蛋白表達(dá)升高。結(jié)論lncRNA TP73-AS1通過p53途徑調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG-2凋亡，為長(zhǎng)鏈非編碼RNA成為臨床肝細(xì)胞癌患者的有效治療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA；共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；肝細(xì)胞癌；凋亡

0　引言

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，每年約有60萬患者被診斷出患有肝細(xì)胞癌[1]。目前，對(duì)于肝細(xì)胞癌的治療主要是手術(shù)切除、肝臟移植、放化療等[2]，但僅有20%的患者能夠被治療[3-4]。我國(guó)肝細(xì)胞癌年死亡率占腫瘤死亡率的第2位[5]。肝細(xì)胞癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚未確定[6]，因此，尋找新的肝細(xì)胞癌的治療方法是研究重點(diǎn)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過200核苷酸的RNA[7-8]，其本身并不編碼蛋白或很少有編碼蛋白質(zhì)的功能[9]。相關(guān)研究表明，與正常組織比較，lncRNA在某些腫瘤，如膽囊癌[10]、肝癌[11]、喉癌[12]、胃癌[13]等的腫瘤組織中的表達(dá)具有顯著差異，這些異常表達(dá)的lncRNA可能在染色質(zhì)修飾、X染色體失活、轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因印記、劑量補(bǔ)償效應(yīng)、蛋白質(zhì)的活性調(diào)控及RNA的可變剪切調(diào)控等過程中發(fā)揮作用[14-15]。但是，關(guān)于lncRNA與肝細(xì)胞癌的研究并不完善。

本文利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與計(jì)算方法首先預(yù)測(cè)了肝細(xì)胞癌相關(guān)的lncRNA，篩選出表達(dá)量最高的lncRNA TP73-AS1；研究lncRNA TP73-AS1在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系增殖凋亡的功能，評(píng)估lncRNA TP73-AS1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)性；就lncRNA TP73-AS1對(duì)于肝癌及其作用的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　方法與數(shù)據(jù)

1.1材料人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG-2由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科丁超饋贈(zèng)，用DMEM高糖(含10%小牛血清)培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)?？笲cl-2、抗Bax、Bad及p53單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling)。

1.2方法

1.2.1MTT法測(cè)定HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率將1×105/L的HepG-2細(xì)胞接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，向培養(yǎng)細(xì)胞中加入lncRNA TP73-AS1-siRNA，轉(zhuǎn)染48 h。每組設(shè)定6個(gè)平行孔，并設(shè)定空白對(duì)照。在吸光度(A570)檢測(cè)。

1.2.2Caspase-3活性檢測(cè)將各組細(xì)胞收集到離心管中，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞，棄去上清，PBS 洗滌1次，離心，再次吸盡上清，加入50 μL裂解液，重懸沉淀，混勻，冰裂解15 min。4 ℃、13 500 r/min離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的1.5 mL離心管中。立即按Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定Caspase-3酶活性，同時(shí)取少量樣品用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3Western blot分析蛋白質(zhì)的提取PBS漂洗各組細(xì)胞2次，4 ℃、5 000 r/min離心10 min。收集細(xì)胞，加入裂解液80 μL (RIPA∶蛋白酶抑制劑=1∶100)，冰上超聲(60 Hz)打碎，10 min/次，13 500 r/min離心15 min吸上清。BCA法測(cè)蛋白濃度。80 μg總蛋白質(zhì)濃度在8%～10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜，然后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h后，PBS沖洗。加入Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)、p53 (1∶500) 4 ℃過夜。用PBS-T緩沖液洗膜3次，15 min/次，然后用紅外熒光標(biāo)記二抗(1∶10 000)對(duì)膜室溫孵育1 h后，用PBS-T沖洗NC膜3次，10 min/次。利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對(duì)膜上蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4Real-time PCR所有RNA均來自于肝細(xì)胞癌HepG-2細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA，USA)，根據(jù)說明書，取約1 μg，用于合成cDNA。通過熒光定量PCR TP73-AS1 lncRNA表達(dá)水平(ABI 7500fast系統(tǒng)，應(yīng)用生物系統(tǒng)，CA，USA)，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。RT-PCR結(jié)果顯示，相對(duì)于lncRNA TP73-AS1和GAPDH的表達(dá)，正向和反向引物序列l(wèi)ncRNA TP73-AS1：5′CCGGTTTTCCAGTTCT TGCAC 3′，5′GCCTCACAGGGAAACTTCATGC 3′；GAPDH：5′TCTACATGTTCCAGTATGACTC 3′，5′ACTCCACGACATACTCAGCACC 3′。

1.3肝癌測(cè)序數(shù)據(jù)來源從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肝癌的外顯子數(shù)據(jù)，整理并建立樣本與基因組成的矩陣模式的表達(dá)譜，包括250個(gè)癌癥樣本、50個(gè)正常樣本。計(jì)算lncRNA、gene的表達(dá)水平。

1.4識(shí)別顯著共表達(dá)lncRNA-gene關(guān)系對(duì)計(jì)算表達(dá)譜上任意lncRNA與任意gene表達(dá)的皮爾森相關(guān)系數(shù)(PCC)，隨機(jī)擾動(dòng)gene、lncRNA標(biāo)簽100次，重新計(jì)算PCC，尋找出顯著相關(guān)的lncRNA-gene關(guān)系對(duì)(PCC>0.7且P<0.01)。

1.5從表達(dá)譜提取差異表達(dá)lncRNA利用R語(yǔ)言程序包EdgeR計(jì)算lncRNA的差異表達(dá)值，以|log2(FoldChange)|>1且EdgeR的FDR<0.25為閾值，獲取差異表達(dá)的lncRNA。

1.6識(shí)別肝癌相關(guān)lncRNA及其下游調(diào)控通路將以上差異表達(dá)lncRNA映射到網(wǎng)絡(luò)中，其中度最大的lncRNA被認(rèn)為是肝癌相關(guān)的lncRNA，并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。將與此lncRNA共表達(dá)的mRNA進(jìn)行KEGG通路映射，尋找下游潛在通路。

2　結(jié)果

2.1lncRNA TP73-AS1在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)構(gòu)建肝癌相關(guān)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。其中包含25 439對(duì)顯著的lncRNA-mRNA關(guān)系。共獲取305個(gè)差異表達(dá)lncRNA，將其映射到上述共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，映射出22個(gè)差異的lncRNA，其中TP73-AS1映射度最高，在網(wǎng)絡(luò)中與62個(gè)基因有顯著的PCC。將lncRNA的62個(gè)互作基因作KEGG pathway map，結(jié)果viral carcinogenesis pathway(病毒致癌作用)被映射出來。TP73-AS1潛在調(diào)控了下游基因CREBBP，且CREBBP能影響下游p53信號(hào)通路(見圖1)，因此，高表達(dá)的TP73-AS1可能通過調(diào)控p53基因起到抑制癌癥的作用。

圖1　lncRNA TP73-AS1與其潛在調(diào)控下游通路

2.2lncRNA TP73-AS1-siRNA對(duì)肝細(xì)胞癌HepG-2細(xì)胞存活率的影響為了驗(yàn)證TP73-AS1是否參與HepG-2凋亡過程，首先通過MTT和AO/EB對(duì)其細(xì)胞活力及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。將TP73-AS1-siRNA轉(zhuǎn)染到HepG-2細(xì)胞中，作用48 h后，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HepG-2的生長(zhǎng)受到抑制(P<0.05)。同時(shí)，AO/EB結(jié)果顯示，HepG-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖2。

圖2　TP73-AS1-siRNA對(duì)HepG-2細(xì)胞活性的改變(n=3)

2.3lncRNATP73-AS1-siRNA對(duì)于肝細(xì)胞癌HepG-2細(xì)胞凋亡通路的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證TP73-AS1是否通過p53誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax，同時(shí)檢測(cè)p53蛋白的變化。結(jié)果顯示，與Control相比，TP73-AS1-siRNA作用48 h后，HepG-2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(n=3，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(n=3，P<0.05)，見圖3(A)；p53蛋白表達(dá)與Control相比明顯上調(diào)(n=3，P<0.05)，見圖3(B)；與Control相比，Caspase-3活性顯著增加(n=3，P<0.05)，見圖3(C)。

3　討論

本文利用生物信息學(xué)方法來識(shí)別肝細(xì)胞癌相關(guān)的lncRNA，首先通過處理高通量測(cè)序數(shù)據(jù)來識(shí)別差異表達(dá)的lncRNA。同時(shí)構(gòu)建肝癌相關(guān)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并將差異表達(dá)的lncRNA映射到該共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中。共有22個(gè)差異表達(dá)的lncRNA被映射到該網(wǎng)絡(luò)中，其中度(連接mRNA個(gè)數(shù))最多的節(jié)點(diǎn)為TP73-AS1。我們認(rèn)為，該lncRNA為肝癌相關(guān)的lncRNA。因?yàn)樗粌H僅是差異表達(dá)的lncRNA，而且潛在的調(diào)控對(duì)象最多，可能廣泛參與了肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的各個(gè)通路過程。此外，我們發(fā)現(xiàn)TP73-AS1可能調(diào)控基因CREBBP，而該基因的下游通路為p53信號(hào)通路。

圖3　TP73-AS1-siRNA對(duì)Bax、Bcl-2 (A)及p53 (B)蛋白的影響，及其Caspase-3活性改變(n=3)

為了驗(yàn)證TP73-AS1是否通過p53信號(hào)通路參與了HepG-2細(xì)胞的凋亡，本研究檢測(cè)了Bcl-2、Bax、p53蛋白的變化，以及Caspase-3活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TP73-AS1-siRNA能夠增加Bax/Bcl-2的比值[16]，而加入TP73-AS1-siRNA作用后，檢測(cè)Caspase-3活性，發(fā)現(xiàn)其活性增加。因此，本研究結(jié)果表明，TP73-AS1是通過激活Caspase-3，進(jìn)而激活p53蛋白，參與HepG-2細(xì)胞凋亡過程，為lncRNA對(duì)于肝細(xì)胞癌的治療提供了理論依據(jù)，同時(shí)為臨床中肝癌的治療提供了新的方法和思路。

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Effect of long non-coding RNA TP73-AS1 on the cell apoptosis of hepatocellular carcinoma HepG-2 cells and its mechanism

ZHANG Hui-rui,JIAO Jun-dong*

(Medical Department,The Second Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150080,China)

ObjectiveTo explore the expression profile of long non-coding RNA (lncRNA) TP73-AS1 in hepatocellular carcinoma,and observe the effect and mechanism of lncRNA TP73-AS1 on the apoptosis of cells of hepatocellular carcinoma.MethodsThe RNASEQ data was downloaded and processed from TCGA database,and significant hepatocellular carcinoma-related co-expression network of lncRNA and mRNA was obtained by using biochemical informatics method.The hepatocellular carcinoma-associated lncRNA TP73-AS1 was identified first.The function was evaluated by MTT,AO/EB and Western Blot.ResultsThere were 25 439 pairs of co-expression of lncRNA-gene,and 22 different lncRNAs were mapped,in which TP73-AS1 was the highest,whose interaction gene (n=62) was mapped to viral carcinogenesis pathway and affected the downstream MAPK pathway and p53 pathway.lncRNA TP73-AS1-siRNA affected the proliferation of HepG-2,up-regulated the expression of Bax,increased the activity of Caspase-3,down-regulated the expression of Bcl-2 and increased the expression of p53.ConclusionlncRNA TP73-AS1 regulates the apoptosis of cells of hepatocellular carcinoma,and it may be a novel prognostic biomarker that could serve as a potential therapeutic target in the treatment of hepatocellular carcinoma.

Long non-coding RNA;Co-expression network;Hepatocellular carcinoma;Apoptosis

2016-02-03

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，哈爾濱 150080

10.14053/j.cnki.ppcr.201608002