李玉秋，段志文，裴秀叢，張玉敏，馬明月

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·論著·

DEHP、MEHP對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞細(xì)胞毒性的研究

李玉秋，段志文，裴秀叢，張玉敏，馬明月*

目的分析不同濃度的鄰苯二甲酸二乙基己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP] 及其活性代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯[mono (2-ethylhexyl) phthalate，MEHP)對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞細(xì)胞毒性、增殖的影響。方法用含有不同濃度DEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)、MEHP (1 000、100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)的培養(yǎng)液，對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果染毒96 h后，高劑量(1 000 μmol/L) DEHP、MEHP均對(duì)胚胎干細(xì)胞的增殖有抑制作用(P<0.05)，且染毒劑量與細(xì)胞抑制率之間存在明顯的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.51、0.62 (P<0.05)。結(jié)論在一定濃度范圍內(nèi)，DEHP及MEHP均對(duì)小鼠ESC具有細(xì)胞毒性，且有濃度依賴性。

DEHP；MEHP；小鼠胚胎干細(xì)胞；細(xì)胞毒性

0　引言

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di (2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]作為可塑劑，全球年產(chǎn)量達(dá)300～400萬噸[1]，廣泛應(yīng)用于包裝材料、醫(yī)療用品、兒童玩具以及化妝品等制造行業(yè)[2]。DEHP僅依靠分子間的作用力，而非化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)與塑料主體基質(zhì)的結(jié)合，因此可以不斷地從塑料制品中游離出來[3]，污染空氣、土壤、水源甚至食物。可經(jīng)消化道、肺和皮膚吸收進(jìn)入人體，以消化道吸收為主。另外，DEHP還可以通過輸液、透析等途徑直接進(jìn)入血液[4]；甚至能通過胎盤屏障直接作用于胎兒，影響胎兒發(fā)育[5]。DEHP在進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)酶作用水解為活性代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單乙基己基酯[Mono(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP]而被吸收，威脅人類的健康。隨著干細(xì)胞研究的發(fā)展，具有無限增殖、自我更新特性[6]的胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)，因其能靈敏、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)毒物的毒性作用，而被廣泛應(yīng)用于各種研究中。本研究使用不同濃度的DEHP及其活性代謝產(chǎn)物MEHP培養(yǎng)小鼠ESC，研究DEHP和MEHP對(duì)小鼠ESC的細(xì)胞毒性。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞小鼠ESC M1細(xì)胞系、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryo fibroblasts，MEF) (C57/BL6，P3 輻照后)均購自中國上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器和試劑SeriesII 3 110 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、超凈工作臺(tái)(中國北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、倒置顯微鏡(中國北京欣惠澤奧科技有限公司)、ST 16離心機(jī)(德國Thermo公司)、酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司)。DEHP(純度：99%，美國Sigma公司)；MEHP(純度：98%，美國Pharmachem公司)；小鼠ES細(xì)胞完全培養(yǎng)基、小鼠ES細(xì)胞分化培養(yǎng)基、AP染色液試劑盒(中國上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12，美國HyClone)；胎牛血清(美國Biochrom)；青霉素-鏈霉素(美國Biological Industries公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；明膠(美國Sigma公司)；CCK-8 細(xì)胞活性試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠ESC的復(fù)蘇與培養(yǎng)T25培養(yǎng)瓶中加入1 mL明膠，使其平鋪培養(yǎng)瓶底，37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)20 min以上，吸棄明膠，加4 mL含10%FBS的MEF培養(yǎng)基備用。從液氮中取出MEF細(xì)胞凍存管，37 ℃水浴鍋中快速解凍并不斷搖動(dòng)。凍存管消毒后，將全部的細(xì)胞懸液移入之前備好的培養(yǎng)瓶中。放于37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)2 d，制成滋養(yǎng)層細(xì)胞。滋養(yǎng)層細(xì)胞長(zhǎng)成熟后，將培養(yǎng)液吸棄，用1 mL小鼠ESC完全培養(yǎng)液清洗1遍，快速復(fù)蘇小鼠ESC并種入(方法如前)，補(bǔ)加小鼠ESC完全培養(yǎng)液至4 mL，在37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。每天換液，培養(yǎng)5～7 d，ESC可進(jìn)行傳代。

1.2.2小鼠ESC的鑒定顯微鏡觀察ESC的生長(zhǎng)及形態(tài)特征。

堿性磷酸酶(AP)染色：①吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS潤(rùn)洗2～3次；②用4%多聚甲醛固定1～2 min，吸出固定液，用PBS洗2次；③吸出PBS，用TBST潤(rùn)洗2次；④準(zhǔn)備堿性磷酸酶試劑：溶液A(白瓶蓋)∶溶液B(綠瓶蓋)∶溶液C=50 μL∶12.5 μL∶437.5 μL；⑤吸棄TBST溶液；⑥加入足量的染色試劑使染色液能足夠覆蓋孔底，室溫避光放置15～20 min；⑦吸出染色液，用PBS緩沖液潤(rùn)洗1次，最后保存于PBS溶液中，顯微鏡下觀察染色結(jié)果(未分化細(xì)胞染色為藍(lán)/紫色，分化的細(xì)胞染色為無色)。

1.2.3DEHP、MEHP的配制將DEHP、MEHP分別溶解于DMSO中，用小鼠ESC分化培養(yǎng)基稀釋得到濃度為10 000 μmol/L的母液(DMSO含量為1%)。之后分別稀釋出含DEHP、MEHP濃度為1 000、100、10、1、0.1 μmol/L的培養(yǎng)液。同時(shí)用小鼠ESC分化培養(yǎng)基配置含1% DMSO的培養(yǎng)液作為對(duì)照。

1.2.4小鼠ESC細(xì)胞活性檢測(cè)用0.25%胰酶將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠ESC消化，收集細(xì)胞。用小鼠ESC分化培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為10×104個(gè)/mL，以100 μL/孔種于96孔板中。溫箱培養(yǎng)24 h貼壁后，將含不同濃度DEHP、MEHP及1% DMSO的培養(yǎng)液以10 μL/孔加入到96孔板中，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔。溫箱培養(yǎng)96 h后，加入CCK8 (10 μL/孔)，溫箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度OD值。第3天換液。

2　結(jié)果

2.1小鼠ESC的鑒定在倒置顯微鏡觀察下，小鼠ESC在MEF為支持的滋養(yǎng)層細(xì)胞上呈克隆生長(zhǎng)，邊緣清晰，細(xì)胞聚集緊密，如圖1。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ESC，用堿性磷酸酶(AP)染色試劑盒染色，未分化的ESC呈藍(lán)紫色細(xì)胞團(tuán)，而分化的細(xì)胞未著色，見圖2。

圖1　小鼠ESC、MEF細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

圖2　小鼠ESC的堿性磷酸酶染色

2.2DEHP、MEHP對(duì)小鼠ESC增殖的影響與對(duì)照組相比，DEHP、MEHP對(duì)小鼠ESC染毒96 h后，高劑量(1 000 μmol/L)組的吸光度值均顯著下降(P<0.05)，見表1。細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。高劑量(1 000 μmol/L)的DEHP、MEHP對(duì)小鼠ESC抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見表1。

表1　DEHP、MEHP對(duì)小鼠ESC細(xì)胞增殖及細(xì)胞抑制率的影響(n=3)

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3不同濃度DEHP、MEHP對(duì)小鼠ESC細(xì)胞活性抑制作用的相關(guān)性DEHP、MEHP的染毒劑量與小鼠ESC受到的抑制作用呈顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.51、0.62 (P<0.05)，見表2。即隨著染毒劑量的增加，DEHP、MEHP對(duì)小鼠ESC活性的抑制作用增強(qiáng)，存在明顯的劑量依存關(guān)系。

表2　不同濃度DEHP、MEHP與小鼠ESC細(xì)胞抑制率的相關(guān)性

3　討論

ESC是指受精卵分裂發(fā)育成囊胚時(shí)，從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass)[7]分離出的細(xì)胞，具有無限增殖、自我更新的特性，無論是在體內(nèi)還是體外環(huán)境，都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有類型的細(xì)胞[6]。由于ESC具有全能性，且在體外連續(xù)傳代并保持未分化狀態(tài)，以及對(duì)受試物作用反應(yīng)迅速、敏感性高、干擾因素少等優(yōu)點(diǎn)[8]，是較好的體外替代試驗(yàn)的生物材料。

自1981年Evans等[9]首次發(fā)現(xiàn)并分離小鼠ESC，1998年Thomson等[10]成功分離人類ESC，研究者們已經(jīng)進(jìn)行了大量的ESC研究，并且成功地建立了大鼠、小鼠、靈長(zhǎng)類等多種動(dòng)物的ESC細(xì)胞系[11]。這些細(xì)胞系中，小鼠、猴和人類的ESC細(xì)胞系可以在體外長(zhǎng)期增殖并保持未分化狀態(tài)[12]，其中小鼠ESC體外分離培養(yǎng)更為簡(jiǎn)單易行[13]，其培養(yǎng)方法也較為完善。Evans等[9]以STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，Wobus等[14]以小鼠原代胚胎成纖維細(xì)胞(Primary embryonic fibroblast，pMEF)為分化抑制物，Nihcol等[15]在培養(yǎng)基中添加LIF作為分化抑制劑，由此可見，目前小鼠ESC培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)基本成熟，并得到了廣泛應(yīng)用。

DEHP是具有第2類生殖毒性的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，已被列入優(yōu)先控制的污染物名單中[16]。其急性毒性較弱，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP對(duì)發(fā)育中及成年動(dòng)物的心、肝、肺、腎及生殖系統(tǒng)等多種組織系統(tǒng)均能產(chǎn)生廣泛的慢性毒性作用，甚至具有致畸性、致突變性和致癌性[17]。Shi等[18]報(bào)道，高劑量(1 000 μmol/L)的MEHP能抑制人ESC細(xì)胞增殖，具有明顯的細(xì)胞毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的細(xì)胞活性。Lim等[19]報(bào)道，1 000 μmol/L MEHP可使小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯降低，與本研究結(jié)果一致。筆者研究發(fā)現(xiàn)，DEHP、MEHP的染毒劑量與細(xì)胞抑制率存在劑量依賴關(guān)系，與Janer等[20]關(guān)于MEHP對(duì)胚胎生長(zhǎng)有濃度依賴性的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的DEHP、MEHP均能抑制小鼠ESC的活性，具有細(xì)胞毒性，且存在劑量依賴關(guān)系，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Effect of DEHP and MEHP on the cytotoxicity of embryonic stem cell of mouse

LI Yu-qiu,DUAN Zhi-wen,PEI Xiu-cong,ZHANG Yu-min,MA Ming-yue*

(Department of Toxicology,School of Public Health,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China)

ObjectiveTo investigate the effect of di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) and mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP) on the cytotoxicity of mouse embryonic stem cells (mESC).MethodsmESC was cultured in the culture media of DEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L) and MEHP (1 000,100,10,1,0.1,0.01 μmol/L).Cell viability was evaluated by CCK8.ResultsThe inhibition rate of 1 000 μmol/L of DEHP and MEHP on mESC after 96 h increased significantly (P<0.05).In addition,the inhibition rate was correlated with the concentration of DEHP and MEHP positively,the correlation coefficient being 0.51 and 0.62 respectively (P<0.05).ConclusionDEHP and MEHP both have dose-dependent cytotoxicity on mESC.

DEHP;MEHP;mESC;Cytotoxicity

2016-03-14

沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，沈陽 110034

沈陽市科技局項(xiàng)目(F14-158-9-22)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2014414)

10.14053/j.cnki.ppcr.201608001