郭藝山，黃向陽，尚紅巖，蘇江濱，徐日益，高亞飛，鄧文偉，康勁菊

(1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2耿馬南華華僑糖業(yè)有限公司酒精分廠，云南耿馬677513；3云南力量生物制品(集團(tuán))有限公司，云南昆明650031)

一種糖蜜酒精酵母中長期保藏技術(shù)的研究

郭藝山1，黃向陽1，尚紅巖1，蘇江濱1，徐日益1，高亞飛1，鄧文偉2，康勁菊3

(1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2耿馬南華華僑糖業(yè)有限公司酒精分廠，云南耿馬677513；3云南力量生物制品(集團(tuán))有限公司，云南昆明650031)

主要介紹一種以改良甘油冷凍保藏法保藏糖蜜酒精酵母菌的技術(shù)。實驗結(jié)果表明，利用改良甘油冷凍保藏法保藏菌株5年，酵母菌體形態(tài)及主要性質(zhì)特征保持良好，且該法操作簡便、經(jīng)濟(jì)有效，可滿足糖蜜酒精生產(chǎn)菌種中長期保藏要求。

糖蜜酒精；酵母；菌種保藏；冷凍保藏法

0　前言

菌種保藏是一項重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作，一個合理的保藏方法可以保持科研和生產(chǎn)所需的優(yōu)良菌種性狀。微生物的保藏原理一般是通過低溫、干燥、隔絕空氣等方法，降低微生物的新陳代謝，延長保藏時間。理論上，只要至少滿足其中一個條件，就可以對菌種進(jìn)行保藏。常用的微生物保藏方法主要有傳代培養(yǎng)保藏、液氮超低溫凍結(jié)保藏、真空冷凍干燥保藏、冷凍甘油保藏等[1-2]。

傳代培養(yǎng)保藏法將菌種定期接種到適宜菌種生長的培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，通常置于4～6℃進(jìn)行保存，每4～6個月移接1次進(jìn)行移植培養(yǎng)。斜面接種傳代保藏法是其最常用的方法，簡單易行，且不要求任何特殊設(shè)備，可用于實驗室中各類真菌的保藏。但是此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、基因突變、菌種污染等現(xiàn)象。同時傳代培養(yǎng)法需要耗費大量的時間和人力，因此此法適用于少量菌種的短期保藏，不適宜大量菌種長期保藏。

冷凍保藏法是將菌種放入低溫保藏的方法，可分為低溫冰箱保藏法(-20℃、-40℃、-80℃)、干冰保藏法(約-70℃)和液氮保藏法(-196℃)。通過冷凍將真菌體內(nèi)水分凝結(jié)，降低其代謝速度，達(dá)到長期保藏的目的[3]。一般而言，冷凍溫度越低，效果越好，液氮中保藏的菌種存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且突變發(fā)生率低。但在冷凍過程中會出現(xiàn)凍傷的現(xiàn)象，凍傷來源于 pH改變、緩沖液凝結(jié)、電解質(zhì)濃度變化、細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶、菌體收縮等因素。低溫過程中冰晶的產(chǎn)生可能會給細(xì)胞帶來致命的傷害，所以在保藏過程中降溫和解凍的過程是需要控制的，慢速的降溫和快速的解凍可以得到較高的復(fù)活率。為了保藏結(jié)果更加優(yōu)異，通常在保藏過程中加入一定的冷凍保護(hù)劑，比如甘油、海藻糖、二甲基亞砜(DMSO)等。據(jù)研究，冷凍保藏法，特別是液氮超低溫保藏，存活率高，突變率低，保藏時間長，是世界培養(yǎng)物保藏協(xié)會推薦的方法之一，但是其缺點是培養(yǎng)物運輸較困難，需要低溫冰箱、液氮罐等特殊設(shè)備。

冷凍干燥保藏法使微生物在冷凍和真空減壓的狀態(tài)下，利用升華現(xiàn)象除去水分，微生物在非劇烈、避免細(xì)胞直接損傷的情況下處于干燥、缺氧狀態(tài)，使細(xì)胞的新陳代謝減慢，從而達(dá)到長期保藏的目的[4]。冷凍干燥保藏法是菌種長期保藏最有效的方法之一，大部分微生物菌種可在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力，而且經(jīng)凍干的菌種無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運輸，但操作過程復(fù)雜，需要冷凍干燥機等設(shè)備。

目前公認(rèn)較理想的菌種長期保藏方法是液氮冷凍保藏和冷凍干燥保藏[5]，但此類方法所需要的設(shè)備復(fù)雜，資金投入大。而當(dāng)前國內(nèi)的糖蜜酒精生產(chǎn)主要以中小型企業(yè)為主，多數(shù)不具備這些長期保藏菌種的條件。本文主要以目前多數(shù)糖蜜酒精生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)備情況與環(huán)境條件為出發(fā)點，探索一種合適的且操作簡易的中長期菌種保藏方法，解決企業(yè)對菌種穩(wěn)定性的核心生產(chǎn)要求，以滿足正常生產(chǎn)需求。

1　材料與方法

1.1材料

菌株：供試糖蜜酒精酵母菌Y-1，Y-2，由本研究室實驗室保存。

糖蜜：82～87 °Bx，由廣東徐聞三和發(fā)展有限公司提供。

40％甘油-生理鹽水：將甘油和生理鹽水按 4：6(v/v)比例均勻混合，高壓滅菌，放置于4℃冰箱冷藏待用。

40％甘油溶液：將甘油和水按4：6(v/v)比例均勻混合，高壓滅菌，放置于4℃冰箱冷藏待用。

平板或斜面培養(yǎng)基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母膏，2％瓊脂粉，高壓滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基：32 °Bx糖蜜，pH4.0，0.2％尿素。

1.2方法

1.2.1冷凍保藏糖蜜酒精酵母方法

1.2.1.1普通甘油冷凍保藏法

將純化的酵母菌接到斜面或平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h，于無菌操作臺用接種針刮取菌落直接接入裝有1 mL滅菌的40％甘油水溶液的菌株保藏管中，制備若干數(shù)量保藏菌株，并做好標(biāo)記，重懸，置于冰箱-20℃冷凍保藏。

1.2.1.2改良甘油冷凍保藏法

將純化的酵母菌接到斜面或平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h，于無菌操作臺用接種針刮取菌落直接接入裝有1 mL滅菌的40％甘油-生理鹽水溶液的菌株保藏管中，制備若干數(shù)量保藏菌株，并做好標(biāo)記，重懸，置于冰箱-20℃冷凍保藏。

1.2.2保藏方法效果評價

(1)不同保藏時間對菌株形態(tài)大小的影響：顯微測微尺法[6]。

(2)不同保藏方式和時間對菌株發(fā)酵特性的影響：選取同一原始菌株進(jìn)行4℃斜面保藏(半年轉(zhuǎn)接1次)，-20℃甘油冷凍保藏，真空冷凍干燥保藏(有外送條件的機構(gòu)進(jìn)行真空冷凍干燥保藏)與-20℃甘油-生理鹽水冷凍保藏，做對比試驗，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后分析成熟醪進(jìn)行評價[7]。

(3)長時間保藏后菌株傳代穩(wěn)定性的影響：選取保藏60個月的菌株進(jìn)行考評，將保藏菌活化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，對每一代菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵成熟醪進(jìn)行測定評價[8-9]。

2　結(jié)果與分析

2.1不同保藏時間對菌株形態(tài)大小的影響

將甘油-生理鹽水冷凍保藏不同時間的 2株糖蜜酒精酵母Y-1，Y-2菌株取樣于顯微鏡下觀察和測定細(xì)胞形態(tài)大小，每個樣隨機測50個細(xì)胞，取平均值。

結(jié)果如表1所示。不同保藏時期的2種酵母形態(tài)大小沒有明顯的變化，說明采用甘油-生理鹽水長期保藏方式，對酵母菌株的形態(tài)大小沒有顯著影響。

表1　不同保藏時間對糖蜜酒精酵母菌株形態(tài)大小的影響

2.2不同保藏方式和時間對菌株發(fā)酵特性的影響

Y-1，Y-2菌株分別保藏 6、12、24、36、48、 60個月并定期對其進(jìn)行發(fā)酵特性分析檢驗，記錄并保存實驗數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1　不同保藏方式和周期對Y-1菌發(fā)酵特性的影響

圖2　不同保藏方式和周期對Y-2菌發(fā)酵特性的影響

分別將2株糖蜜酒精酵母菌Y-1，Y-2的甘油-生理鹽水冷凍保藏菌(改良法保藏菌)、甘油冷凍保藏菌(甘油冷凍菌)、斜面保藏菌(斜面?zhèn)鞔?及真空干燥冷凍保藏菌(凍干菌)接種到小三角瓶活化并進(jìn)行擴培，離心去除上清液，取1 g左右酵母泥接入帶有發(fā)酵栓的500 mL三角瓶(內(nèi)裝200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基)，32℃培養(yǎng)72 h后，測定成熟醪含酒量。

由圖1和圖2可見，在中長期保藏周期5年內(nèi)，真空冷凍干燥保藏法能夠長期穩(wěn)定地保持糖蜜酒精酵母Y-1，Y-2菌株發(fā)酵特性，是保藏條件允許下較好的菌株保藏方式。同時，甘油-生理鹽水冷凍保藏菌亦表現(xiàn)出良好的發(fā)酵特性，且優(yōu)于普通甘油冷凍保藏法，這可以表明生理鹽水在菌株凍結(jié)過程中對細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用；而斜面轉(zhuǎn)接菌株則出現(xiàn)一定程度的波動，在1年左右時間內(nèi)斜面轉(zhuǎn)接菌株能夠保持較好的發(fā)酵特性，之后隨著保藏時間的推移與轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，發(fā)酵特性呈現(xiàn)退化的現(xiàn)象。綜上可知，對糖蜜酒精酵母保藏的方式，短期可以選擇斜面?zhèn)鞔２胤绞剑婵崭稍锢鋬霰２嘏c甘油-生理鹽水冷凍保藏方式可適用于中長期保藏。

2.3保藏60個月后菌株穩(wěn)定性試驗

通過對甘油-生理鹽水-20℃冷凍保藏60個月后的Y-1，Y-2菌株做穩(wěn)定性試驗，結(jié)果如表2所示。10代發(fā)酵試驗中Y-1，Y-2菌株發(fā)酵產(chǎn)酒能力與殘?zhí)撬骄憩F(xiàn)出相對穩(wěn)定的狀況，同時對其顯微鏡檢觀察酵母形態(tài)，未見變形拉伸絮凝等退化現(xiàn)象，各代呈現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)較為均勻飽滿。由此表明，甘油-生理鹽水冷凍長期保藏后酵母細(xì)胞具有較好的傳代穩(wěn)定性。

3　結(jié)論

表2　甘油-生理鹽水冷凍保藏60個月的菌株穩(wěn)定性試驗

通過連續(xù)5年對不同種糖蜜酒精酵母Y-1，Y-2菌株進(jìn)行研究表明，菌種保藏短期可以選擇斜面?zhèn)鞔２胤绞剑婵崭稍锢鋬霰２嘏c甘油-生理鹽水冷凍保藏方式可適用于中長期保藏。其中甘油-生理鹽水冷凍保藏方式能較好地保持菌種細(xì)胞形態(tài)，中長期保藏后的菌種依然保持良好的傳代穩(wěn)定性及發(fā)酵特性。同時，該保藏方法所需儀器設(shè)備及保藏條件要求不高，操作方法簡易可行，可為多數(shù)企業(yè)在生產(chǎn)過程中避免因頻繁轉(zhuǎn)接而可能造成的菌種污染、衰老和退化現(xiàn)象，是比較適合中小糖蜜酒精生產(chǎn)企業(yè)采用的菌種中長期保藏方法。

[1] 呂紅線，郭利美.工業(yè)微生物菌種的保藏方法[J].山東輕工學(xué)院報，2004，21(1)：52-55.

[2] 陳秀英.菌種保存方法的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2004，12(2)：231-232.

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[4] SMITH D, RYAN M J.The impact of OECD best practice on the validation of cryopreservation techniques for microorganisms[J].Cryo Letters, 2008, 29(1): 63-72.

[5] 周德慶.微生物學(xué)教程：第 2版[M].北京：高等教育出版社，2002.

[6] 顧國賢.釀造酒工藝學(xué)[M].北京：輕工業(yè)出版社，1996.

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[9] 徐日益，梁磊，郭藝山，等.耐高滲透糖蜜釀酒酵母的紫外誘變逐級馴化選育[J].甘蔗糖業(yè)，2012(6)：39-42.

（本篇責(zé)任編校：李金玉）

Study on Medium to Long-Term Preservation Technology of Molasses Alcohol Yeast

GUO Yi-shan1, HUANG Xiang-yang1, SHANG Hong-yan1, SU Jiang-bin1, XU Ri-yi1, GAO Ya-fei1, DENG Wen-wei2, KANG Jin-ju3
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316;2Gengma Nanhua Huaqiao Sugar Co.Ltd., Gengma, Yunnan 677513;3Yunnan Power Biological Products (Group) Co.Ltd., Kunming 650031)

The improved glycerol freezing preservation method of preserving molasses alcohol yeast was introduced.The results showed that the morphology and main characteristics of yeast remained good after 5 years in the improved glycerol freezing preservation with simple operation and economical efficiency, which could satisfy medium and long term preservation requirements of molasses alcohol production strains.

Molasses alcohol; Yeast; Culture collection; Freezing preservation

TS249.3

B

1005-9695(2016)03-0038-04

2016-06-03；

2016-06-15

廣東省科技計劃項目(2013B010102002、2014A010107017、2016B070701005)；廣東省科學(xué)院科研平臺環(huán)境與能力建設(shè)專項資金項目(2016GDASPT-0208)

郭藝山(1984-)，男，工程師，研究方向：制糖綜合利用與工業(yè)微生物代謝與調(diào)控

郭藝山，黃向陽，尚紅巖，等.一種糖蜜酒精酵母中長期保藏技術(shù)的研究[J].甘蔗糖業(yè)，2016(3)：38-41.