周　梅，　瞿智玲，　白靖平，　岳　娜，　阿迪拉

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 1病理科 3骨科，烏魯木齊　8300112華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所，武漢　430030

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臨床研究

Tie2、Ang1和Ang2蛋白在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)及臨床意義*

周梅1，瞿智玲2，白靖平3△，岳娜1，阿迪拉1

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1病理科3骨科，烏魯木齊8300112華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所，武漢430030

目的探討Tie2、Ang1和Ang2蛋白在血管異常(血管瘤和血管畸形)中的表達(dá)。方法收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2005年至2012年血管畸形50例，皮膚增殖期血管瘤30例，正常組織20例，采用免疫組化SP法檢測(cè)Tie2、Ang1和Ang2蛋白在血管異常中的表達(dá)。結(jié)果Tie2在血管異常中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，而Ang1在血管異常中的陽(yáng)性表達(dá)率較低，Tie2在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)顯著高于正常組織，Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)顯著低于正常組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；Tie2和Ang2在血管異常中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論Ang1蛋白表達(dá)降低可能破壞了血管的穩(wěn)定性，有助于病變的發(fā)展，Tie2蛋白表達(dá)增高，其與Ang2結(jié)合對(duì)病變血管生成可能具有促進(jìn)作用，Tie2、Ang1和Ang2表達(dá)失衡在血管異常的發(fā)病過(guò)程中可能起重要的調(diào)節(jié)作用。

血管畸形；血管瘤；Tie2；Ang1；Ang2

血管異常在臨床多見(jiàn)，可分為良性血管腫瘤和血管畸形。血管異常可能與血管形成中的調(diào)節(jié)因素改變有關(guān)，這些調(diào)節(jié)因素包括Ang/Tie2系統(tǒng)，Ang/Tie2系統(tǒng)通過(guò)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管周細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)血管生成和重塑。Tie2是酪氨酸激酶受體，血管生成素Ang1和Ang2是Tie2受體的配體。Ang1是Tie2的啟動(dòng)劑，Tie2受體與Ang1結(jié)合使血管穩(wěn)定。Ang2是Ang1的拮抗劑，可競(jìng)爭(zhēng)性地與Tie2結(jié)合，抑制Ang1的作用。

本課題選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2005年至2012年血管畸形病例50例，皮膚增殖期血管瘤30例，正常組織20例進(jìn)行研究，旨在通過(guò)免疫組化的方法探討血管異常的發(fā)病機(jī)制。

1　材料與方法

1.1臨床資料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2005年至2012年血管異常病例80例，其中軟組織血管畸形病例50例，男20例，女30例，年齡3～61歲，平均年齡26.8歲；皮膚增殖期血管瘤病例30例，男10例，女20例；年齡1～12個(gè)月，平均年齡5.7個(gè)月，另選取正常組織20例作對(duì)照。

1.2主要試劑

Tie2(BS-1300 R)為兔抗人單克隆抗體，Ang1(OTI8H2)和Ang2(OTI4A3)蛋白均為鼠抗人單克隆抗體，Tie2、Ang1和Ang2抗體稀釋度分別為(1∶200、1∶150、1∶100)，Tie2蛋白免疫組化試劑盒購(gòu)自于博奧森生物有限公司，Ang1和Ang2蛋白免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

全部標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，將標(biāo)本制備成4 μm厚的切片，按SP免疫組化試劑盒推薦染色步驟進(jìn)行操作。

1.4結(jié)果判定

Tie2、Ang1和Ang2蛋白陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量分級(jí)：<25%為(-)，25%～為(+)，50%～為()，>75%為()。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，兩組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

皮膚增殖期血管瘤由分葉狀毛細(xì)血管構(gòu)成，小葉間為纖維結(jié)締組織分隔，小葉內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞較幼稚，增生較活躍，管腔結(jié)構(gòu)不明顯，內(nèi)皮細(xì)胞核較大，核分裂像偶見(jiàn)；而血管畸形由被覆單層扁平內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)大血管腔隙構(gòu)成，無(wú)核分裂像，細(xì)胞無(wú)明顯異型，管壁發(fā)育不良，有不規(guī)則的管壁平滑肌缺失(圖1A、1B)。在血管異常中，Tie2的陽(yáng)性表達(dá)率較高，表達(dá)較強(qiáng)(圖1C、1D)，Ang2的陽(yáng)性表達(dá)率稍高，表達(dá)也稍強(qiáng)(圖1E、1F)，而Ang1的陽(yáng)性表達(dá)率較低，表達(dá)較弱。Tie2在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)高于正常組織，Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)低于正常組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表1、表2；而Ang2在血管異常和正常組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Tie2和Ang2在血管異常中的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3，但Tie2與Ang1蛋白間無(wú)明顯相關(guān)性。

A：增殖期血管瘤，由分葉狀毛細(xì)血管瘤構(gòu)成，細(xì)胞較幼稚(HE，×100)；B：血管畸形，由被覆單層扁平內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)大血管腔隙構(gòu)成(HE，×100)；C：Tie2在血管瘤中的陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×200)；D：Tie2在血管畸形中的陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×200)；E：Ang2在血管瘤中的陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×200)；F：Ang2在血管畸形中的陽(yáng)性表達(dá)(IHC，×200)圖1　增殖期血管瘤和血管畸形的組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及免疫組化表達(dá)結(jié)果Fig.1 Morphological characteristics of proliferating hemangioma and vascular malformation and the immunohistochemical results

類(lèi)型Tie2+-Ang2+-Ang1+-血管瘤2551713327正常組織7131191010χ212.1690.0149.979P0.0000.9070.002

表2　Tie2、Ang2、Ang1蛋白在血管畸形中的表達(dá)

表3　Tie2和Ang2蛋白在血管異常中表達(dá)的相關(guān)性分析

3　討論

國(guó)際脈管性疾病研究協(xié)會(huì)(ISSVA)于2007年根據(jù)臨床、影像學(xué)、病理解剖特征將血管異常分為良性血管腫瘤和血管畸形[1]。血管瘤中最常見(jiàn)的是皮膚嬰兒毛細(xì)血管瘤，Bischoff[2]運(yùn)用多態(tài)性X染色體相關(guān)人類(lèi)男性雄激素受體基因和非隨機(jī)X染色體滅活狀態(tài)的方法證實(shí)了嬰兒毛細(xì)血管瘤為單克隆增生，而血管畸形由結(jié)構(gòu)異常的血管通道構(gòu)成，可能是胚胎血管形成的調(diào)控途徑異常所致[3]。遺傳學(xué)研究顯示部分嬰兒毛細(xì)血管瘤存在5q丟失和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的錯(cuò)義突變[4]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血管畸形的發(fā)生與基因缺陷有關(guān)，這些基因中包括靜脈血管畸形的Tie2基因突變[5]，但血管異常的發(fā)病機(jī)制還尚未明確。

Tie2是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成員，與EGF受體及免疫球蛋白具有同源性，其基因定位于9p21，Tie2在內(nèi)皮細(xì)胞及某些造血內(nèi)皮祖細(xì)胞中特異性的表達(dá)，而且均勻表達(dá)于胚胎時(shí)期血管內(nèi)皮細(xì)胞，在肺內(nèi)皮細(xì)胞，肉芽組織等血管生成活躍的血管內(nèi)皮中表達(dá)較高，對(duì)血管生成和心血管發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用[6-7]。促血管生成素1(Angiopoietins1，Ang1)是Tie2的配體，Ang1在正常組織中表達(dá)廣泛，Ang1分泌后進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中，在血管新生及維持血管完整與穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用[8]。Ang1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有趨化作用，可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽。Ang1啟動(dòng)Tie2受體后，使內(nèi)皮周?chē)交〖?xì)胞和血管周細(xì)胞募集至血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)ㄟ^(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞與周?chē)С旨?xì)胞之間的相互作用，維持血管的完整性與穩(wěn)定性，使血管的滲透性降低。Ang1是血管成熟的重要因子[9]，無(wú)論是Ang1或Tie2蛋白缺乏均會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的微血管缺陷，使小鼠死于胚胎期[10]，因此，Ang1和Tie2是血管形成中重要的角色。本研究顯示Tie2蛋白在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)顯著高于正常組織，而Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)顯著低于正常組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示Tie2和Ang1在血管瘤和血管畸形的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，Ang1表達(dá)降低，破壞了血管的穩(wěn)定性，有助于病變的發(fā)展，Tie2蛋白表達(dá)增高對(duì)病變血管生成可能具有促進(jìn)作用。

Ang2基因位于8p23.1染色體上，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮旁細(xì)胞分泌。Ang2是Ang1的天然拮抗劑，主要分布于子宮、卵巢和胎盤(pán)等部位，可能與這些組織的血管重建有關(guān)。Ang2是Tie2的配體，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其為無(wú)信號(hào)傳導(dǎo)功能，不能引起Tie2受體的磷酸化，但能競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷Ang1的效應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞移行，Ang2與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞間的作用可能在早期能促進(jìn)新生血管的形成。一些體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang2和Angl具有相似的作用，高濃度的Ang2與Ang1類(lèi)似，能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活[11]。Ang2與Tie2結(jié)合后，對(duì)血管的生成具有雙重調(diào)節(jié)作用，其作用主要依賴于周?chē)h(huán)境中其它促血管生成因子，尤其是VEGF，在組織當(dāng)中存在VEGF的情況下，Ang2可通過(guò)阻斷Ang1的作用，破壞血管的穩(wěn)定性，促進(jìn)新生血管形成。在缺乏VEGF的情況下，由于Ang2抑制Ang1/Tie2途徑的作用，導(dǎo)致血管發(fā)生斷裂、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、使血管發(fā)生消退[12]。本研究顯示Ang2在血管異常和正常組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示Ang2在血管異常和正常組織的血管形成中均具有調(diào)節(jié)作用。

Ang1和Ang2的比例平衡調(diào)控著血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，血管的靜止?fàn)顟B(tài)是通過(guò)Ang1-Tie2信號(hào)維持的。血管異常中Ang/Tie2的表達(dá)情況目前國(guó)內(nèi)外研究和報(bào)道較少。Malik等[13]研究發(fā)現(xiàn)Tie2和Ang2等在嬰幼兒血管瘤組織中表達(dá)增高，而Ang1表達(dá)較低。Hashimoto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Ang2在靜脈系統(tǒng)中的表達(dá)是降低的，然而在腦動(dòng)靜脈畸形(BAVM)中，Ang2的表達(dá)卻明顯升高，提示Ang2在血管局部微環(huán)境中的作用占主導(dǎo)地位時(shí)，將有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化和形成新生血管。本課題研究結(jié)果顯示Tie2蛋白在血管異常中的表達(dá)率較高，陽(yáng)性率為78.75%，Ang2表達(dá)的陽(yáng)性率也稍高，陽(yáng)性率為51.25%，Tie2和Ang2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而Ang1蛋白在血管異常中的表達(dá)率較低，陽(yáng)性率為18.75%，本組研究與文獻(xiàn)報(bào)道一致，也顯示了Ang/Tie2表達(dá)的不平衡。Ang1和Ang2是Tie2基因的配體，Angl與Tie2基因結(jié)合起維持血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，而Ang2作為Ang1的拮抗劑，競(jìng)爭(zhēng)性地與Tie2基因結(jié)合，導(dǎo)致Angl與Ang2在局部表達(dá)失衡，Ang1/Tie2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)受抑，阻斷了Ang1穩(wěn)定血管活性的作用，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞與血管周?chē)?xì)胞之間的粘附及相互作用減弱，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)與血管基底膜裂解，內(nèi)皮細(xì)胞和血管周?chē)g質(zhì)細(xì)胞失去聯(lián)系，結(jié)構(gòu)松散，血管壁發(fā)育不良，破壞了血管的穩(wěn)定性，同時(shí)在VEGF等生長(zhǎng)因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖、遷移，誘導(dǎo)血管的形成[15-16]。Ang/Tie2體系表達(dá)失衡在血管異常的發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，Ang1在血管異常中的表達(dá)降低，可能破壞了血管的穩(wěn)定性，而Tie2蛋白在血管異常中的表達(dá)增高，Tie2與Ang2結(jié)合后對(duì)病變血管的形成可能具有促進(jìn)作用，Ang/Tie2體系表達(dá)失衡在血管畸形和血管瘤的發(fā)病過(guò)程中可能均具有一定的調(diào)節(jié)作用，但Ang/Tie2體系蛋白在血管畸形及血管瘤中的作用機(jī)制及其相互關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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(2016-02-01收稿)

Expression of Tie2，Ang1，and Ang2 Proteins in Hemangioma and Vascular Malformation

Zhou Mei1，Qu Zhiling2，Bai Jingping3△etal

1DepartmentofPathology，3DepartermentofOrthopedics，AffiliatedTumorHospital，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China2DepartmentofPathology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo investigate the expression of Tie2，Ang1 and Ang2 proteins in hemangioma and vascular malformation.MethodsSpecimens of 50 cases of vascular malformation and 30 cases of skin proliferating hemangioma were collected from patients who were treated during 2005-2012 in the Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，and 20 cases of normal tissue were used as control.The immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of Tie2，Ang1 and Ang2 proteins in vascular anomalies.ResultsThe positive expression rate of Tie2 was significantly higher in vascular anomalies than in control group，but the positive expression rate of Ang1 was much lower in vascular anomalies than in control group.There were significant differences in the expression rate of Tie2 and Ang1 between vascular anomaly group and control group(P<0.05).The expression of Tie2 was positively associated with that of Ang2 in vascular anomalies(P<0.05).ConclusionThe reduced expression of Ang1 protein may undermine the stability of blood vessels，and contribute to the development of the lesion.The increased expression of Tie2 protein，when combined with Ang2，may promote angiogenesis.The imbalance of Tie2，Ang1 and Ang2 may play an important regulatory role in the pathogenesis of vascular anomalies.

vascular malformation；hemangioma；Tie2；Ang1；Ang2

，Corresponding author，E-mail：baijingping1022@sina.com

R365

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.016

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360282)

周梅，女，1973年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：zmzg168@sina.com