時永強，祝宇，王奇惠，張賽飛，曲偉杰

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南 昆明650201）

豬巴氏桿菌病的病原分離鑒定及藥敏試驗

時永強，祝宇，王奇惠，張賽飛，曲偉杰

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南 昆明650201）

為了及時鑒定豬巴氏桿菌病，對疾病做出準確額治療。本實驗通過細菌分離、生化試驗、動物試驗、藥敏試驗等方法對規(guī)?；B(yǎng)豬場的三例疑似巴氏桿菌病例豬進行病原菌分離鑒定、藥敏試驗等系列檢測。結(jié)果顯示，從三例疑似巴氏桿菌病例豬中均分離到了巴氏桿菌；三例豬巴氏桿菌病例的高敏藥物分別是：左氧氟沙星、頭孢哌酮、左氧氟沙星。本實驗成功分離了巴氏桿菌并對其進行了藥敏試驗，對豬巴氏桿菌病的準確診斷以及治療提供一定的理論依據(jù)。

豬巴氏桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

豬巴氏桿菌病（Swinepasteurellosis）是由多殺性巴氏桿菌引起的急性流行性或散發(fā)性和繼發(fā)性傳染病。多殺性巴氏桿菌為細小的球桿狀或短桿狀菌，兩端鈍圓，近似橢圓形，在培養(yǎng)物中呈圓形、卵圓形或桿狀，單在，有時成雙排列，病料涂片用瑞氏染色或美蘭染色時，可見明顯的兩極著色。新分離的強毒菌株具有粘液性莢膜，但經(jīng)培養(yǎng)后迅速消失。本菌無芽胞，無鞭毛。革蘭氏染色陰性。陽光直射下數(shù)分鐘死亡，高溫立即死亡，一般消毒液均能殺死［1］。

本菌為條件病原菌，常存在于健康豬的呼吸道，與宿主呈共棲狀態(tài)。當豬飼養(yǎng)在不衛(wèi)生的環(huán)境中，由于感受風寒、饑餓等因素使機體抵抗力降低時，該菌乘虛侵入體內(nèi)，經(jīng)淋巴液入血液引起敗血癥。該病主要經(jīng)消化道感染，其次通過飛沫經(jīng)呼吸道感染，亦有經(jīng)皮膚傷口或蚊蠅叮咬而感染的。該病常年可發(fā)生，在氣溫變化大、陰濕寒冷時更易發(fā)??；常呈散發(fā)性或地方流行性發(fā)生［2］。

在本病的防治過程中常采用的方法免疫接種和抗菌藥物。通過藥敏試驗可以篩選出高敏的藥物，如左氧氟沙星，頭孢哌酮［3］。但抗菌藥物的大量使用，巴氏桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬，由此而造成的危害十分嚴重，它不僅使抗菌藥的療效降低，療程延長，死亡率升高和治療費用增加。這不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，而且耐藥菌株可能會發(fā)生基因突變突破種間障礙進而對人類健康也造成潛在威脅。因此，臨床上應合理應用抗菌藥物，以避免或減少耐藥性的產(chǎn)生，而合理應用抗菌藥物控制畜禽疾病的一項重要內(nèi)容就是通過藥敏試驗指導臨床用藥，以充分發(fā)揮抗菌藥物療效，并盡可能減少其不良影響。

通過分析現(xiàn)階段豬致病性巴氏桿菌的分離鑒定以及藥敏試驗，一是有利于規(guī)?；B(yǎng)豬場巴氏桿菌病的防治，減少因巴氏桿菌菌病導致的經(jīng)濟損失，二是防止耐藥菌株的出現(xiàn)，正確指導臨床科學用藥，力求針對性用藥，防止盲目用藥。

1　材料與方法

1.1主要儀器

電恒溫培養(yǎng)箱（購于上海一恒科學儀器有限公司）、超凈工作臺（購于蘇州工業(yè)園區(qū)華都凈化空調(diào)技術(shù)有限公司）、高壓滅菌器（購于上海博迅實業(yè)有限公司公司）、冰箱（購于昆明塔洛制冷技術(shù)有限公司）、離心機（購于湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、移液槍、接種環(huán)、塑料培養(yǎng)皿購于常用玻璃器械等。

1.2主要試劑及藥品

1.2.1培養(yǎng)基

血清瓊脂、血清肉糖、1%蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、普通培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基脫纖維綿羊血購于昆明錦昂科技有限公司；細菌生化鑒定管購于杭州濱和生物有限公司。

1.2.2藥敏試紙

哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢唑林、阿米卡星、四環(huán)素、氨芐西林、磺胺、慶大霉素、氯霉素、左氧氟沙星、頭孢他啶（購于浙江濱和微生物試劑有限公司）。

1.3病例來源

取自規(guī)?；i場：分別記為病例一、病例二、病例三，發(fā)病病例經(jīng)流行情況調(diào)查、癥狀檢查進行初步診斷。

1.4方法

1.4.1臨床癥狀觀察及剖檢

通過對豬只表現(xiàn)的臨床癥狀進行觀察并記錄，同時對豬只進行剖檢，觀察期組織器官病理變化。

1.4.2病原菌分離培養(yǎng)及純化培養(yǎng)

無菌操作，解剖病豬，將疑似為豬巴氏桿菌病的病料如心血、肝、脾在超凈臺上用燒紅的刀片燒烙滅菌肝、脾病變區(qū)和正常區(qū)交界處表面，然后用該刀片在燒烙部位的表面切開一小口，用接種環(huán)深入挑取少量病料組織分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h，進行細菌分離培養(yǎng)。

然后以無菌操作挑取單個灰白色、圓形的典型菌落接種于鮮血瓊脂平板上分區(qū)劃線進行純培養(yǎng)，倒置放于37℃培養(yǎng)24-28h后，將平板放置于4℃冰箱中備用。

1.4.3分離菌的形態(tài)學觀察

取5%豬鮮血瓊脂平板中的單個菌落涂片，進行革蘭氏染色和瑞士染色。

革蘭氏染色過程：（1）在已干燥固定（火焰固定）好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，經(jīng)1-2分鐘，水洗。（2）加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3分鐘，水洗。（3）加95%酒精于抹片上脫色，約0.5-1分鐘，水洗。（4）加稀釋的沙黃水溶液復染10-30秒，水洗。（5）自然干燥。

瑞士染色過程：（1）取病料涂片、自然干燥（2）滴加瑞氏染液染3分鐘，使標本被其中甲醛所固定；（3）加等量PH6.4的磷酸鹽緩沖液（或等量超純水）輕輕晃動玻片，均勻靜置5分鐘；（4）水洗、吸干、鏡檢。

鏡檢：油鏡下檢查菌體形態(tài)染色特點，對分離菌進行初步鑒定［4］。

1.4.4生化鑒定

分別勾取分離菌純培養(yǎng)物無菌接種于上述各種生化試驗培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24-48h后判定結(jié)果。

1.4.5藥敏試驗

對3起豬巴氏桿菌病例進行了紙片法藥敏試驗［6］。具體過程如下：（1）取無菌的平皿于超凈工作臺（2）取高壓滅菌的生理鹽水5mL與1-2個菌落混合制成菌液，將菌液倒入平皿，使覆蓋培養(yǎng)基表面，菌液涂布整個培養(yǎng)基表面后再倒出；（3）按畫好的標記貼上藥敏試紙；（4）放入37℃、24h培養(yǎng)。

1.4.6動物回歸性試驗

將昆明小鼠隨機分為四組，分別為標為A、B、C、D。其中ABC三組為實驗組，D為對照組，實驗組分別注射0.5ml的分離菌液，D組則注射相同的生理鹽水，觀察其臨床癥狀。

2　結(jié)果

2.1臨場癥狀及病理變化

病豬體溫升高到41℃以上，精神差，食欲減少或廢絕，初為干性短咳，后變濕性痛咳，鼻孔流出漿性或膿性分泌物，觸診胸壁有疼痛感，聽診有啰音或摩擦音，呼吸困難，張口吐舌［5］。剖檢可見，肺小葉間質(zhì)水腫、增寬，有不同發(fā)展時期的肝變區(qū)，病變部質(zhì)度堅實如肝，切面有暗紅、灰紅、灰白或灰黃等不同色彩，呈大理石樣外觀。支氣管內(nèi)充滿分泌物。胸腔和心包內(nèi)積有多量淡紅色混濁液體，內(nèi)混有纖維素。胸膜和心包膜粗糙無光澤，上附纖維素，甚至心包和胸膜或者肺與胸膜發(fā)生粘連。胸部淋巴結(jié)腫大或出血。

2.2病原菌分離培養(yǎng)及純化培養(yǎng)

將病料培養(yǎng)18h-24h后，分離菌在鮮血瓊脂平板上形成灰白色圓形微隆起、半透明、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的豐盛的露珠樣菌落，不溶血［7］。

2.3分離菌的形態(tài)學檢查

革蘭氏染色鏡檢可見到革蘭氏陰性兩端鈍圓、以單個或成雙排列形態(tài)均勻一致的小桿菌；瑞士染色鏡檢，觀察到大量兩極濃染的小桿菌［8］。

2.4生化試驗

對分離到的3株致病菌分別進行了生化試驗，結(jié)果符合豬巴氏桿菌的特征。見表1。

2.5藥敏試驗

由表2可知各實驗組的高敏藥物分別為：病例一為左氧氟沙星；病例二為頭孢哌酮；病例三為左氧氟沙星。

表1　生化實驗結(jié)果

2.6動物回歸試驗結(jié)果

實驗組的小鼠死亡，而對照組的小鼠依然存活，將實驗組的小鼠剖檢，去病料用接種環(huán)挑取少量病理組織接種到鮮血培養(yǎng)基中，經(jīng)過染色鏡檢以及生化試驗成功分離到巴氏桿菌。

表2　巴氏桿菌藥敏試驗結(jié)果　單位：mm

3　討論

3.1本次實驗所分離的巴氏桿菌生長出直徑1～2 mm，圓形，光滑，半透明，濕潤的菌落，在鮮血瓊脂平板上無溶血現(xiàn)象，在普通平板上生長貧瘠，形成細小的菌落，在麥康凱瓊脂平板上不表現(xiàn)生長。實驗結(jié)果符合巴氏桿菌的培養(yǎng)特性。取分離菌進行生化試驗，結(jié)果不液化明膠；能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，但產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖、山梨醇、鼠李糖和木糖；尿素、O-F試驗為發(fā)酵型。符合多殺性巴氏桿菌的生化試驗特征。同時，所分離的菌株在小白鼠致病試驗中均能使實驗動物致死，死亡動物體內(nèi)所分離出的細菌與所接種的病原菌相同，可以說明在本試驗病例體內(nèi)分離出的菌株為致病性巴氏桿菌。

3.2生化試驗表明，多數(shù)分離菌株完全符合豬巴氏桿菌生化特性，但也有部分菌株在個別項目上不符，因此，在做豬巴氏桿菌的生化試驗時，應多設(shè)一些有針對性的項目，以便在個別項目不符時，不致誤判。

3.3藥敏試驗結(jié)果顯示，豬巴氏桿菌存在廣泛的耐藥性，豬場在治療豬巴氏桿菌病時，不要盲目的用藥，加大用藥劑量，最好做藥敏試驗篩選出高敏藥物，交替進行治療。

3.4臨床上本病的發(fā)生與飼料、飲水污染、氣候變化、環(huán)境衛(wèi)生等有密切的關(guān)系。因此，臨床防治本病，除了注射疫苗、合理選擇用藥外，應從飼料、衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理等方面綜合考慮，才能到達預期的效果。

3.5研究仔防治豬巴氏桿菌的意義：隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，由豬巴氏桿菌引起豬巴氏桿菌病表現(xiàn)出很多種類型是目前養(yǎng)豬場影響仔豬存活率的重要制約因素，所以研究防治豬巴氏桿菌病在實際生產(chǎn)中具有重要的意義。

4　結(jié)論

4.1從三例病例中均分離到了豬巴氏桿菌，確診三例病例為豬巴氏桿菌病。

4.2三例豬巴氏桿菌病例的高敏藥物分別是：左氧氟沙星、頭孢哌酮、左氧氟沙星。

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S855.1

B

1003-8655（2016）04-0102-03

∶時永強（1989—），山東威海人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床診斷研究。E-mail：syqboy1@163.com

曲偉杰（1978—），副教授，學歷博士，碩士生導師，研究方向動物營養(yǎng)代謝病與中毒病