吳　靜，趙潤鵬，徐雪維，王　婉，楊小康，胡　東

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與檢驗(yàn)教研室，安徽　淮南　232001；2. 安徽理工大學(xué)免疫與感染研究所，安徽　淮南　232001)

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雞六種病毒多重PCR檢測方法的建立和應(yīng)用

吳靜1,2，趙潤鵬1，徐雪維1，王婉1，楊小康1，胡東1,2

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與檢驗(yàn)教研室，安徽淮南232001；2. 安徽理工大學(xué)免疫與感染研究所，安徽淮南232001)

禽流感(Avian influenza, AI)、雞新城疫(Newcastle disease, ND)、雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis, IB )、雞傳染性喉氣管炎( Infectious laryngotracheitis, ILT)、雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和雞減蛋綜合癥(Egg drop syndrome 76,EDS-76)是6種常見的禽類病毒性傳染病，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。依據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中禽流感病毒(Aiv)、新城疫病毒(Ndv)、雞傳染性支氣管炎病毒(Ibv) 、傳染性法氏囊病(Ibdv)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Iltv)及減蛋綜合征病毒(Edsv)基因序列, 設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物, 建立并優(yōu)化針對(duì)雞Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的多重PCR鑒別診斷方法, 同時(shí)進(jìn)行現(xiàn)場檢測應(yīng)用。結(jié)果顯示該多重PCR體系檢測限為100fg，與其他常見病原體無交叉反應(yīng)。研究表明雞六種病毒多重PCR方法具有較高敏感性與特異性，在禽類常見病毒現(xiàn)場診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

多重PCR; 禽流感病毒; 新城疫病毒; 雞傳染性支氣管炎病毒; 雞傳染性喉氣管炎病毒

禽流感( Avian influenza, AI)、雞新城疫( Newcastle disease, ND)、雞傳染性支氣管炎( Infectious bronchitis, IB )、雞傳染性喉氣管炎( Infectious laryngotracheitis, ILT)、雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)和雞減蛋綜合癥(Egg drop syndrome 76,EDS-76)是6種常見的禽類病毒性傳染病，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。早期快速診斷對(duì)于控制疫情具有重要意義。多重PCR能夠同時(shí)檢測多種病原體，可對(duì)混合感染進(jìn)行鑒別診斷，并且較之于血清學(xué)診斷、病原分離鑒定等常規(guī)診斷方法，具有快速高效，靈敏度高的優(yōu)勢。但已報(bào)道的多重PCR體系僅能對(duì)三種禽類RNA病毒進(jìn)行檢測，限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用[4]。本實(shí)驗(yàn)建立了可同時(shí)對(duì)上述6種禽類病毒進(jìn)行鑒別診斷的多重PCR體系, 并對(duì)自然感染的病雞進(jìn)行了現(xiàn)場檢測。

1　材料與方法

1.1毒株

禽流感病毒( Aiv)重組禽流感病毒滅活疫苗H5N1亞型購自青島易邦生物工程有限公司；雞傳染性喉氣管炎病毒( Iltv)活疫苗株購自梅里亞動(dòng)物保健有限公司；新城疫病毒( Ndv )La Sota株、雞傳染性支氣管炎病毒( Ibv) H120株、雞傳染性法氏囊病毒(IBD)疫苗株、雞減蛋綜合癥(EDS-76)標(biāo)準(zhǔn)毒株AV-127、禽呼腸孤病毒( ARV )及禽腺病毒( ADV)均由浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。大腸桿菌、沙門氏菌與副豬嗜血桿菌由我室保存[5-6]。

1.2主要試劑

Trizol Reagent RNA提取試劑盒購Invitrogen公司；TIANamp Genomic DNA Kit購自TIAN GEN公司；DNA瓊脂糖膠回收試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；rTaq DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、隨機(jī)引物(9 mer)、dNTP(10 mmol/μL)和DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。無菌PBS( pH7. 2) 自行由DEPC水配置。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

于NCBI核酸數(shù)據(jù)庫檢索目的基因序列，Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)6對(duì)能同時(shí)擴(kuò)增上述6種雞病毒的特異性引物(見表1)，采用NCBI-BLAST工具驗(yàn)證引物特異性。引物由上海生工公司合成。

表1　多重PCR擴(kuò)增Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv及Edsv的引物序列

1.4病毒核酸的提取和cDNA合成

嚴(yán)格按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書提取Ibdv、Iltv、Edsv和ADV的基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆肹7]。根據(jù)Trizol Reagent RNA提取試劑盒說明書提取Aiv、Ndv、Ibv和ARV的總RNA，并立即反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：采用20 μL的cDNA合成體系，Aiv、Ndv或Ibv的總RNA樣品2 μL，分別加入5×RT緩沖液4 μL,Random primer(9 mer ) 1 μL，dNTP (2.5 mM) 8 μL，RNA酶抑制劑( 40 U/ μL) 0.5 μL，AMV 2μL，DEPC水補(bǔ)足20μL，置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成，以25 ℃ 10 min、42 ℃ 60 min、99 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min的程序進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，cDNA合成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.5多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化與特異性實(shí)驗(yàn)

紫外吸收法測定病原模板D260 nm/D280 nm值進(jìn)行核酸定量，以無菌超純水調(diào)整至100 ng/μL。將Aiv、Ndv、Ibv的cDNA和Ibdv、Iltv、Edsv的DNA以等濃度混合，在不同的引物比例、引物濃度、Taq DNA聚合酶及退火溫度的條件下進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。

1.6多重PCR的特異性和敏感性試驗(yàn)

在確定的最佳PCR反應(yīng)條件下，對(duì)單個(gè)及混合病原模板進(jìn)行擴(kuò)增，并通過對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌與副豬嗜血桿菌菌液、ADV的DNA、ARV的cDNA分別進(jìn)行多重PCR，檢測該多重PCR體系的特異性[9-11]。將上述等濃度混合的cDNA∕DNA以無菌超純水稀釋至各病原模板濃度均1ng/μL，再進(jìn)行10倍系列濃度稀釋得到1ng/μL～10 fg/μL的7個(gè)質(zhì)量濃度，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增以檢測該多重PCR的敏感性。

1.7多重PCR對(duì)自然感染雞樣品的檢測

在無菌條件下采取送檢的具有相關(guān)癥狀病雞的肺、氣管、脾、子宮及法氏囊組織, 加入5倍體積的PBS，剪碎研磨, 反復(fù)凍融3次, 3 000 r/min 離心10 min, 取適量上清液, 進(jìn)行RNA或DNA抽提。同時(shí)收集病雞的喉氣管棉拭子，置于適量PBS充分振蕩洗滌，室溫靜置10 min，待大塊狀物下沉后，將棉拭子吸帶的液體在壁上盡量擠干，棄去棉拭子，3 000 r/min離心10 min，取沉淀用于RNA或DNA提取?？鼓獦颖? 000 r/min離心10 min，吸取上清沸水浴15 min，自然冷卻后作為擴(kuò)增模板。然后使用建立的多重PCR方法進(jìn)行Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的檢測[12]，擴(kuò)增產(chǎn)物以DNA瓊脂糖膠回收試劑盒回收并進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站檢索比對(duì)以確定病毒種類。

2　結(jié)果

2.1多重PCR反應(yīng)條件的建立

多重PCR通過退火溫度、引物濃度和Taq酶濃度等的優(yōu)化以后, 確立最佳的反應(yīng)條件如下: cDNA 合成( 25 μL體系) : RNA樣品2 μL, 5×RT緩沖液4 μL,Random primer(9mer ) 1μL,dNTP (2.5 mM) 8μL, RNA酶抑制劑( 40 U/μL) 0.5 μL, AMV2μL,DEPC水補(bǔ)足20μL。合成程序:25 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增(50 μL體系) : 10×PCR 緩沖液( Mg2+Plus) 5μL, rTaq DNA聚合酶0.5 μL( 5U /μL), dNTP混合物(10mmol/Leach) 1μL , 100 pmol/ μL的Ibdv、Iltv和Edsv上、下游引物各1.2 μL, 100 pmol/μL的Aiv、Ndv與Ibv上、下游引物各0.8 μL, cDNA/ DNA混合模板18μL, 用超純水補(bǔ)足總體積至50μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性45 s, 50 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃終延伸10 min, 4 ℃結(jié)束反應(yīng)。取5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL 6×Loading buffer混合，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠120 V電泳40 min，GelRed染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相記錄結(jié)果。

2.2多重PCR的特異性和敏感性試驗(yàn)

建立的多重PCR體系對(duì)6種目的病毒的單個(gè)及混合模板在最佳條件下進(jìn)行擴(kuò)增，得到的條帶分子量均與預(yù)期相符，分別為679bp(Ibdv)、497bp(Ibv)、427bp(Iltv)、289bp(Edsv)、268bp(Aiv)和136bp (Ndv)?；旌夏０鍞U(kuò)增的產(chǎn)物條帶清晰，亮度相近(見圖1)。在相同條件下，以Aiv的cDNA作為陽性對(duì)照，以無菌超純水作為陰性對(duì)照，對(duì)其他動(dòng)物病原模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)未見陽性結(jié)果(見圖2)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示, 建立的多重PCR體系至少能同時(shí)擴(kuò)增單種濃度為100 fg/μL的目的病毒模板(見圖3)。

M : DNA Marker; 1: Ibdv; 2: Ibv; 3: Iltv; 4: Edsv; 5: Aiv; 6: Ndv; 7: Ibdv; 2: Ibdv+Ibv+Iltv+Edsv+Aiv+Ndv. 圖1　Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的多重PCR檢測

M: DNA Marker; 1: Aiv; 2: H2O; 3: Arv; 4: Adv; 5:E.coli; 6: Salmonella; 7: Haemophilus parasuis圖2　對(duì)照病原模板檢測多重PCR體系的特異性

M:DNA Marker;1: 1ng/μL；2: 100pg/μL；3: 10pg/μL；4: 1pg/μL；5: 100fg/μL；6: 10fg/μL.圖3　多重PCR體系的靈敏度檢測

2. 3多重PCR對(duì)自然感染雞樣品的檢測

使用該多重PCR體系對(duì)送檢的具有呼吸道癥狀、腹瀉、蛋殼變化等癥狀的病雞, 進(jìn)行Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv檢測。結(jié)果表明, 從送檢的雞血液、組織器官及喉氣管棉拭子樣本中檢測到單一Ndv、Ibv、Iltv和Edsv以及混合病毒感染, 但沒有檢測到Aiv與Ibdv的感染(見圖4)。測序結(jié)果與Nucleotide登錄序列BLAST顯示，Ndv鑒定株與Nucleotide中Ndv SG/Liaoning/2009， chicken/Shandong/N2/2008等同源性為99%，Ibv鑒定株與GenBank中Ibv isolate India/NMK/72/IVRI/10株同源性為94.8%。Iltv鑒定株與GenBank中Iltv, U.S. field isolate 632, chicken 99.2%。Edsv鑒定株與Eggdrop syndrome-1976 virus hexon protein (L3 II) genes同源性為100%。

M : DNA Marker; 1: Ibv; 2:Iltv; 3:Ibv﹢Edsv; 4:Ndv; 5: Edsv.圖4　多重PCR體系對(duì)臨床樣品的檢測結(jié)果

3　討論

病毒感染在養(yǎng)雞業(yè)較為常見，尤其是Aiv、Ibv、Ndv、Ibdv、Iltv及Edsv感染，一直對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的危害。這6種禽類病毒傳染性強(qiáng)，易于出現(xiàn)爆發(fā)性感染和混合性感染。Aiv、Ibv、Ndv、Iltv屬于呼吸道病毒，病理變化和臨床特征均十分相似，實(shí)際工作中難以區(qū)分[13]。Edsv感染在臨床上僅以產(chǎn)蛋量突然下降以及產(chǎn)蛋質(zhì)量異常為特征，無其他明顯的臨床癥狀與剖檢病變，極易與其他病毒感染引起的產(chǎn)蛋下降相混淆[14]。Ibdv具有殺淋巴細(xì)胞性而導(dǎo)致雞群免疫抑制，并發(fā)其他病原的混合感染。常規(guī)的檢測方法難以對(duì)此6種病毒進(jìn)行快速高效的鑒別診斷, 影響了臨床及時(shí)有效的采取控制疫情的措施，制約了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。本試驗(yàn)建立的多重PCR體系可對(duì)以上6種家禽病毒進(jìn)行快速的種別鑒定, 為此種疫情的防治、控制和撲滅提供了技術(shù)支持。

多重PCR技術(shù)的反應(yīng)體系較常規(guī)PCR有較高的要求。我們?cè)趯?duì)本研究中的每種待檢病毒進(jìn)行普通PCR檢測成功的基礎(chǔ)上，不斷調(diào)適引物比例、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度及退火溫度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，確定了最為合適的檢測條件。各待檢病毒在相應(yīng)體系中均能擴(kuò)增出目的基因片段，顯示了該體系的特異性。同時(shí)，該多重PCR體系至少能同時(shí)擴(kuò)增單種濃度為100 fg/μL的目的病毒模板, 表明其具有較高的敏感性。另外，本方法還顯示對(duì)其他物種DNA的抗干擾能力，在該體系以大腸桿菌、沙門氏菌與副豬嗜血桿菌菌液、ADV的DNA、ARV的cDNA為對(duì)照模板進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)中，均未顯示陽性結(jié)果。從標(biāo)本RNA∕DNA提取、RNA的逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)到凝膠電泳結(jié)束，可以7h內(nèi)完成，能夠?qū)?種臨床多見或正逐漸增多的病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，顯示本方法具有較高的效率。

由于受到相關(guān)國家法律法規(guī)的約束, 該實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)人工感染雞的樣本進(jìn)行檢測，只對(duì)自然感染的具有相關(guān)癥狀的病雞采肺、氣管、脾、血液、子宮及法氏囊組織，應(yīng)用建立的多重PCR 進(jìn)行Aiv、Ndv、Ibv、Ibdv、Iltv和Edsv的檢測，成功地檢測到Ndv、Ibv、Iltv和Edsv病原，但沒有檢測到Aiv與Ibdv的感染，也與采樣地沒有Aiv和Ibdv疫情出現(xiàn)的實(shí)際情況相符合。在比較PCR擴(kuò)增、測序結(jié)果與現(xiàn)場剖檢資料時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，數(shù)例確診病雞僅有精神萎靡、食量下降等病毒感染的早期不典型癥狀，同時(shí)我們還檢測出混合感染的病雞，顯示該體系在早期診斷與鑒別診斷具有重要優(yōu)勢。

需要注意的是，雞場在防控疾病時(shí)免疫接種弱毒疫苗，可能會(huì)影響對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確判定。弱毒疫苗株在體內(nèi)復(fù)制，可能會(huì)造成多重PCR檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果，這也是流行病學(xué)調(diào)查許多禽畜傳染病時(shí)的一個(gè)難題[15]。所以在使用該技術(shù)時(shí)，應(yīng)該考慮疫苗接種史，緊密結(jié)合臨床發(fā)病指征、解剖病變及流行病學(xué)進(jìn)行綜合診斷，必要時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，以幫助正確判斷疫情。在今后的研究中，我們將增加該體系對(duì)不同來源毒株的檢測，加大對(duì)臨床樣本的直接診斷，使該技術(shù)更加程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，在養(yǎng)雞業(yè)發(fā)揮更大的實(shí)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：何學(xué)華，吳曉紅)

Establishment and Application of a Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of six Chicken-related Virus

WU Jing1,2，ZHAO Run-peng1, XU Xue-wei1, WANG Wan1,YANG Xiao-kang1, HU Dong1,2

(1. Department of Immunology and Laboratory Medicine, Medical School,Anhui University of Science and Technology,Huainan,Anhui 232001,China; 2. Institute of Infection and Immunology,Anhui University of Science and Technology,Huainan,Anhui 232001,China)

Avian influenza virus (Aiv) , New castle disease virus (Ndv), Infectious bronchitis virus (Ibv), Infectious laryngo tracheitis virus (Iltv), Infectious bursal disease virus (Ibdv) and Egg drop syndrome virus (Edsv) combine to be the six common chicken-related viruses, which pose great threat to poultry industry. According to the gene sequences of the six common viruses in Nucleotide GenBank, six pairs of specific primers were designed and a multiplex PCR for simultaneous detection of the six viruses was established and optimized. At the same time, some clinical samples were detected. The result shows that this method is performed with a detection limit of 100 fg which had no cross reaction to other pathogens. This study indicates that this method has a good sensitivity and specificity, and it may have an expanded application to the diagnosis of viral diseases in poultry.

multiplex PCR; Aiv; Ndv; Ibv; Iltv

2015-10-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81571528；81202294；81302524)；安徽省高校自然科學(xué)產(chǎn)學(xué)研基金資助項(xiàng)目(KJ2013A105)；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1208085QH162)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(201210361112；201210361121)；安徽理工大學(xué)青年科技拔尖人才基金資助項(xiàng)目。

吳靜(1980-)，女，安徽淮南人，副教授，博士，研究方向：腫瘤免疫。

S831.7

A

1672-1098(2016)03-0008-05