宋成憲　李　舜　馮楓華　謝澤良　簡(jiǎn)穎敏.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)科，廣東廣州　5050；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院康復(fù)科，廣東廣州　5055

脈沖磁療對(duì)腦出血大鼠腦內(nèi)谷氨酸和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1表達(dá)的影響

宋成憲1李舜1馮楓華1謝澤良1簡(jiǎn)穎敏2▲
1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)科，廣東廣州510150；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院康復(fù)科，廣東廣州510515

目的 觀察脈沖磁療對(duì)腦出血大鼠腦組織中谷氨酸和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）表達(dá)的影響。方法 清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組和磁療組，每組又分為3 d組和7 d組，每個(gè)亞組各6只大鼠。采用立體定向技術(shù)制作腦出血模型。磁療組于術(shù)后2 h開(kāi)始脈沖磁療干預(yù)，異名磁極對(duì)置于頭部，磁距10 cm，平均磁場(chǎng)強(qiáng)度0.01 T，頻率50 Hz，20 min/次，1次/d。并于腦出血3、7 d時(shí)分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定、谷氨酸和IGF-1濃度的測(cè)定。結(jié)果 磁療3、7 d組改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分（mNSS）均比對(duì)應(yīng)的模型組下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腦出血后，腦組織中谷氨酸表達(dá)增加，經(jīng)過(guò)脈沖磁療3、7 d后，谷氨酸濃度均明顯下降，低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常腦組織內(nèi)IGF-1有少量表達(dá)，腦出血后，其表達(dá)增加；經(jīng)過(guò)磁療3、7 d后，與模型組相比，IGF-1水平均明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 脈沖磁療可以一定程度上促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與谷氨酸水平的下降和IGF-1的表達(dá)增加有關(guān)。

脈沖磁療；腦出血；谷氨酸；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1

［Abstract］Objective To observe the effects of pulsed magnetic therapy on the expression of glutamate and insulinlike growth factor-l（IGF-1）after cerebral hemorrhage in rats.Methods 36 male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=12），model group（n=12）and magnetic therapy group（n=12）.Each group was randomly divided into 3 d and 7 d subgroups，with 6 rats in each subgroup.The cerebral hemorhage model of rats was made using the technology of stereotaxis.The magnetic therapy group was treated with pulsed magnetic therapy（0.01 T，50 Hz，20 min/times，1 times/d）after hemorrhage 2 h.The modified neurological severity score（mNSS），the concentration of glutamate and IGF-1 were evaluated at 3 d and 7 d after cerebral hemorrhage.Results Compared to the model group，the mNSS scores in 3 d and 7 d magnetic therapy group decreased significantly（P＜0.01）.After cerebral hemorrhage，the concentration of glutamate increased；in the magnetic therapy group，the concentration of glutamate was significantly decreased than in the model group after hemorrhage 3 d and 7 d（P＜0.01）.IGF-1 had little expression in the normal brain tissue，after cerebral hemorrhage，its expression increased；the concentration of IGF-1 in the magnetic therapy group was significantly increased than in the model group after hemorrhage 3 d and 7 d（P＜0.01）.Conclusion Pulsed magnetic therapy can promote the recovery of neural function in rats.This effect may be associated with the decline of glutamate and the higher expression of IGF-1.

［Key words］Pulsed magnetic therapy；Cerebral hemorrhage；Glutamate；Insulin like growth factor-l

腦出血后局部組織的水腫和繼發(fā)性的神經(jīng)細(xì)胞損傷是影響預(yù)后的重要因素。一方面，腦組織損傷的同時(shí)可以引起興奮性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）水平的升高，適量的EAA對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性是必需的，但高濃度的EAA則具有神經(jīng)毒性。谷氨酸作為EAA的一種，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高。另一方面，腦組織損傷后，可引起內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的啟動(dòng)，其中包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）表達(dá)的增加。脈沖磁療是臨床常用的物理治療方法，許多研究都已經(jīng)證實(shí)它可以促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，但對(duì)于其具體的作用機(jī)制，尚不十分清楚。本研究通過(guò)脈沖磁療干預(yù)腦出血大鼠，探討其對(duì)谷氨酸和IGF-1表達(dá)的影響，期望進(jìn)一步明確磁療在腦出血治療方面的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD雄性大鼠36只，體重230～290 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK（粵）2011-0015，室溫、常濕飼養(yǎng)，普通飼料，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和磁療組，每組又分為3 d組和7 d組兩個(gè)亞組，每個(gè)亞組各6只大鼠。

1.2試劑與儀器

磁療儀為解放軍總醫(yī)院研制的GMC-B型脈沖磁療儀，脈沖磁場(chǎng)強(qiáng)度0～1.5 T，磁脈沖電流寬度＜10 MS，脈沖頻率20～80次/min，電源220 V、50 Hz。谷氨酸分析儀為日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀。放射免疫設(shè)備為SN-682型放射免疫γ計(jì)數(shù)器，上海核福光電儀器有限公司生產(chǎn)。IGF-1放射免疫試劑盒由天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供。

1.3方法

1.3.1腦出血模型制作參考既往文獻(xiàn)的造模方法進(jìn)行腦出血模型的制作［1-2］。大鼠稱重后用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上，使前囟和后囟處在同一平面。常規(guī)備皮消毒，沿頭正中切開(kāi)一長(zhǎng)約10 mm的切口，切開(kāi)骨膜，暴露前囟。定位于前囟前0.5 mm，右側(cè)旁開(kāi)3 mm，用牙科鉆在此處鉆一直徑約1 mm的小孔。取血前將大鼠尾置于40℃溫水中加熱5 min，消毒后距末端1 cm處剪斷，取未抗凝血50 μL沿所鉆小孔進(jìn)針深約6 mm（此處為大鼠尾狀核頭部），以20 μL/min的速度緩慢勻速注入血液，注血結(jié)束后留針5 min后緩慢退針，縫合切口，以上操作均嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則。假手術(shù)組除不注血外，余步驟同上。術(shù)后大鼠回籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。如死亡或未出現(xiàn)偏癱癥狀，則被剔除，隨機(jī)補(bǔ)充剔除標(biāo)本，保證最終每組納入的大鼠數(shù)量一致。

1.3.2脈沖磁療干預(yù)方法參考既往研究的磁療處方［3］。磁療組動(dòng)物于術(shù)后2 h開(kāi)始用脈沖磁療儀進(jìn)行干預(yù)。異名磁極對(duì)置于大鼠頭部，磁距為10 cm。平均磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.01 T，頻率為50 Hz，20 min/次，1次/d。

1.3.3標(biāo)本制備各組大鼠分別在腦出血3、7 d時(shí)予10%水合氯醛（0.45 mL/100 g）深度麻醉，迅速打開(kāi)胸腔，眼科剪剪開(kāi)右心耳，自左心室灌注0.9%生理鹽水，快速?zèng)_洗體內(nèi)血液，致流出液清亮為止，再續(xù)用4%多聚甲醛250 mL進(jìn)行灌注固定，然后斷頭取腦。沿針孔處作冠狀切開(kāi)，有明顯血腫且無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血，未破入腦室者為模型制作成功。模型組和治療組在冰盤上切取以血腫為中心周圍腦組織100 mg，假手術(shù)組則取相應(yīng)部位腦組織100 mg，進(jìn)行勻漿、離心后取上清液置于-20℃冰箱保存待測(cè)。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定于造模成功后3、7 d時(shí)進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺失評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）評(píng)定。評(píng)定項(xiàng)目包括平衡木實(shí)驗(yàn)、行走測(cè)試、反常運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)測(cè)試、反射缺失和提尾反射等，最低為0分，最高分為18分；0分為神經(jīng)功能正常，得分越高說(shuō)明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重［4］。

1.4.2谷氨酸含量的測(cè)定將標(biāo)本從冰箱取出后，常溫解凍后，4℃4800 r/min離心15 min，然后嚴(yán)格按照日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀的要求進(jìn)行谷氨酸濃度的測(cè)定。

1.4.3IGF-1含量測(cè)定將標(biāo)本從冰箱取出后，常溫解凍。取每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清和樣本100 μL于相應(yīng)編號(hào)的試管中，每管均加入100 μL的標(biāo)志物工作液。除T管（總放射性管）、NSB管（非特異性結(jié)合管）以外的各管均加入100 μL抗體工作液，充分混勻后置于4℃溫育24 h，然后加500 μL分離劑，充分混勻，靜置30 min，4℃3600 r/min離心20 min，棄上清液，用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定沉淀物每分鐘的放射性活性值，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣本的濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定

假手術(shù)組術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定基本正常，各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分均為0分。模型組、磁療組與假手術(shù)組比較均有神經(jīng)功能損傷；3、7 d時(shí)，模型組和磁療組mNSS評(píng)分比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；并且，兩組7 d時(shí)的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均低于各自3 d時(shí)的評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　各組mNSS評(píng)定結(jié)果比較（分，）

表1　各組mNSS評(píng)定結(jié)果比較（分，）

組別　3 d　7 d　t值　P值模型組磁療組2.847 2.932 0.017 0.015 t值　P值8.67±0.81 6.83±0.75 4.082 0.002 7.33±0.82 5.50±0.82 3.865 0.003

2.2谷氨酸檢測(cè)結(jié)果

正常腦組織內(nèi)谷氨酸有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，腦出血后，其表達(dá)明顯增加，模型組與假手術(shù)組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；7 d較3 d時(shí)谷氨酸水平有所下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)脈沖磁場(chǎng)治療3、7 d后，與模型組相比，谷氨酸濃度均有明顯下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；磁療7 d時(shí)谷氨酸濃度低于3 d時(shí)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2　各組谷氨酸水平比較（μmol/g，）

表2　各組谷氨酸水平比較（μmol/g，）

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別　3 d　7 d　t值　P值假手術(shù)組模型組磁療組F值P值4.62±0.21 8.84±0.83*7.41±0.65*#71.555 0.000 4.60±0.27 7.64±0.55*5.51±0.56*#59.919 0.000 0.143 2.952 5.424 0.889 0.014 0.000

2.3IGF-1檢測(cè)結(jié)果

正常腦組織內(nèi)IGF-1有少量表達(dá)。腦出血后，其表達(dá)明顯增加，模型組與假手術(shù)組相比，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；7 d較3 d時(shí)有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)過(guò)脈沖磁場(chǎng)治療3、7 d后，與假手術(shù)組和模型組相比，IGF-1水平均有明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；雖然磁療7 d時(shí)IGF-1水平有所下降，但與3 d組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3　各組IGF-1放射免疫測(cè)定結(jié)果比較（ng/mL，）

表3　各組IGF-1放射免疫測(cè)定結(jié)果比較（ng/mL，）

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

組別　3 d　7 d　t值　P值假手術(shù)組模型組磁療組F值P值0.85±0.14 2.36±0.18*2.75±0.22*#176.716 0.000 0.87±0.11 2.07±0.27*2.69±0.26*#101.766 0.000 0.275 2.189 0.431 0.789 0.053 0.675

3　討論

腦出血后血腫周邊及遠(yuǎn)隔部位可出現(xiàn)不同程度的腦血流下降，下降程度與血腫的大小和部位有關(guān)，即存在類似于腦梗死后缺血半暗帶的病理變化［5］。腦組織的缺血缺氧，可以引起細(xì)胞外EAA水平的升高，適量的EAA是神經(jīng)細(xì)胞維持活性所必需的，而高濃度的EAA則具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的EAA，平時(shí)儲(chǔ)存在神經(jīng)元突觸前囊泡中，在突觸前膜去極化時(shí)釋放到突觸間隙。腦出血后腦組織中谷氨酸的表達(dá)明顯增加，且表達(dá)的高低同血腫殘腔的體積呈正相關(guān)［6］。有學(xué)者認(rèn)為，腦組織缺血缺氧后谷氨酸大量釋放所造成的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要原因［7］。腦細(xì)胞外不存在谷氨酸代謝酶，谷氨酸的代謝清除主要由位于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)完成。但腦出血后，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的水平持續(xù)下調(diào)，谷氨酸的清除能力下降［8］。故如果能探索出某種治療方法，減少腦出血后谷氨酸的表達(dá)，則理論上可以起到減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。

IGF-1是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈堿性多肽分子，對(duì)哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育具有至關(guān)重要的作用，它通過(guò)激活I(lǐng)GF-1受體，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、突觸生長(zhǎng)及髓鞘形成［9］。IGF-1在成年腦組織中低水平表達(dá)，腦損傷后，IGF-1的水平顯著升高，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用［10］。吳紅瑛等［3］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血2 h時(shí)，半暗帶區(qū)域IGF-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開(kāi)始升高，并且IGF-1升高的水平與神經(jīng)功能缺失呈負(fù)相關(guān)。有研究表明，給予外源性的IGF-1也可以起到類似的神經(jīng)保護(hù)作用［11］。但目前尚沒(méi)有見(jiàn)到外源性IGF-1用于治療人顱腦損傷的報(bào)道，且外源性IGF-1價(jià)格昂貴，能否通過(guò)血腦屏障仍不明確。故如能探索出某種干預(yù)方法使內(nèi)源性IGF-1的表達(dá)增加，對(duì)于腦損傷的治療，將會(huì)有更大的應(yīng)用價(jià)值。

脈沖磁療作為一種安全、簡(jiǎn)便的物理因子治療方法，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、高血壓等多種疾病的治療具有確切的效果［12-14］。近年也有研究表明，低頻脈沖磁療可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生、增殖與分化，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。有人將其用于外周神經(jīng)及中樞神經(jīng)損傷的治療，取得了一定的臨床效果，但其確切的機(jī)制仍不十分明確［15-16］。

本研究結(jié)果顯示，腦出血3 d和7 d時(shí)，模型組和磁療組大鼠均存在神經(jīng)功能損傷，模型組雖然沒(méi)有磁療干預(yù)，但7 d時(shí)的mNSS評(píng)分仍低于3 d時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明腦損傷后具有一定的自我修復(fù)功能。磁療3 d組和7 d組mNSS評(píng)分均低于相應(yīng)的模型組，說(shuō)明脈沖磁療可以促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。兩組mNSS評(píng)分隨時(shí)間的變化與谷氨酸下降的趨勢(shì)一致，而與IGF-1的濃度變化趨勢(shì)相反。推測(cè)神經(jīng)功能的恢復(fù)可能與谷氨酸濃度的下降及IGF-1水平的升高有關(guān)。當(dāng)然，該結(jié)果是在特定的實(shí)驗(yàn)條件下得出的，可能不同的磁場(chǎng)劑量、治療時(shí)間、檢測(cè)方法等會(huì)得出不同的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果，對(duì)此需要更深入的論證。

本研究結(jié)果顯示，脈沖磁療可以引起腦缺血組織中IGF-1水平的升高，與既往的研究結(jié)果一致［3］。此外，有研究表明，損傷局部給予外源性的IGF-1后，可以抑制腦出血后谷氨酸的表達(dá)，從而減輕了其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷［17］。對(duì)于谷氨酸水平的下降，除了IGF-1的作用外，脈沖磁療是否也可以通過(guò)其他途徑影響谷氨酸的分泌或者清除？有研究顯示，脈沖磁療可以引起缺血腦組織周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)增加［18］。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的主要細(xì)胞，它可以將細(xì)胞外液中90%的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而將其分解生成谷氨酰胺，從而減輕其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒性［19-20］。雖然本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有直接對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞或其特征性標(biāo)志物進(jìn)行觀察，但本研究結(jié)果也間接驗(yàn)證了上述理論的合理性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，脈沖磁療可引起腦出血后血腫局部的谷氨酸水平下降，IGF-1的表達(dá)增加，一定程度上促進(jìn)了腦出血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。當(dāng)然本實(shí)驗(yàn)也有許多不足之處，沒(méi)有進(jìn)行連續(xù)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的觀察，無(wú)法具體明確谷氨酸和IGF-1的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)；此外，對(duì)于脈沖磁療引起谷氨酸和IGF-1變化的具體作用機(jī)制，有待更深入的研究。

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Effects of pulse magnetic therapy on expression of glutamate and insulinlike growth factor-1 after cerebral hemorrhage in rats

SONG Chengxian1LI Shun1FENG Fenghua1XIE Zeliang1JIAN Yingmin2▲
1.Department of Rehabilitation Medicine，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510150，China；2.Department of Rehabilitation Medicine，Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510515，China

R743

A

1673-7210（2016）08（a）-0020-04

2016-05-03本文編輯:程銘）

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院青年基金項(xiàng)目（2012Y10）。

宋成憲（1982.10-），男，南方醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)創(chuàng)傷骨科專業(yè)在讀博士研究生；研究方向:神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病康復(fù)。