覃　媛　蔡　軼　張　曼　趙　莉廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院蛇毒與生物毒素研究所，廣東廣州　511436

1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的培養(yǎng)和功能研究

覃媛蔡軼張曼趙莉
廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院蛇毒與生物毒素研究所，廣東廣州511436

目的 研究1型糖尿病小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的培養(yǎng)方法和血管原性功能。方法 采用7～8周雄性C57/B6小鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素建立1型糖尿病小鼠模型，同時設(shè)立正常對照組，連續(xù)5 d給等量的檸檬酸緩沖液。采用密度梯度離心法分離并培養(yǎng)糖尿病小鼠骨髓EPCs；通過MTT法、Matrigel、改良Boyden小室分別檢測EPCs的增殖、遷移和小管形成的功能性指標(biāo)。結(jié)果 與正常對照組比較，培養(yǎng)獲得1型糖尿病小鼠的EPCs增殖減少，其遷移和小管形成能力明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論 成功培養(yǎng)1型糖尿病小鼠骨髓EPCs，EPCs的血管原功能受損。

1型糖尿?。粌?nèi)皮祖細(xì)胞；增殖；遷移；小管形成

［Abstract］Objective To study the culture and biological function of bone marrow endothelial progenitor cells（EPCs）in type 1 diabetic mice.Methods C57/B6 male mice with 7-8 weeks old were intraperitoneal injected Streptozotocin to establish type 1 diabetic mice model.While normal control group was set up，and was given the same amount of citric acid buffer for 5 day.EPCs were isolated and cultured by density gradient method from diabetic mice.EPC proliferation were evaluated by using the MTT colorimetric assay.EPC migration was measured by transwell method.EPC tube formation ability was estimated by Matrigel.Results Compared with control mice，the proliferation，migration and tube formation of diabetic EPCs were deceased（P＜0.05）.Conclusion Bone marrow endothelial progenitor cells in type 1 diabetic mice were successfully cultured，and the function of diabetic EPCs was impaired.

［Key words］Type 1 diabetes mellitus；Endothelial progenitor cells；Proliferation；Migration；Tube formation

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類能增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。自Asahara首次從循環(huán)外周血中分離出能分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs后，越來越多的報道證實EPCs可在成年組織中修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，且參與生理性和病理性的血管新生［1-3］。糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥，近年大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病EPCs的數(shù)量和功能改變與血管并發(fā)癥的關(guān)系密切［4-5］。因此糖尿病EPCs成為人們研究的一個熱點。近年國內(nèi)對EPCs進(jìn)行了許多研究報道［6-8］，但有關(guān)1型糖尿病EPCs的分離培養(yǎng)和功能研究報道極少。因此，本實驗旨在建立1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的培養(yǎng)方法，并觀察1型糖尿病小鼠的EPCs增殖、遷移和小管形成等多種功能，為深入研究糖尿病EPCs的功能障礙奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

SPF級的C57/B6雄性小鼠（20～23 g）30只購自廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心（4400720523）；異氟烷購自山東科源制藥；淋巴細(xì)胞分離液、纖連蛋白、鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；DiI-acLDL購自美國Molecular Probe公司；EGM-2培養(yǎng)基購自 Lonza公司。

1.2方法

1.2.1小鼠1型糖尿病模型的建立選用7～8周雄性C57/B6小鼠，連續(xù)5 d給予小鼠腹腔注射小劑量STZ 45 mg/（kg·d），正常對照組連續(xù)5 d給予等量的檸檬酸緩沖液。1周后測小鼠空腹血糖，連測3 d。空腹血糖高于16.7 nmol/L即確認(rèn)為糖尿病小鼠。

1.2.2糖尿病骨髓EPCs的培養(yǎng)先用纖連蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)皿，置37℃孵育1 h后。取糖尿病7周小鼠消毒脫臼致死，取出四肢，剃除肌肉，將取出的骨頭去除關(guān)節(jié)端，暴露骨髓腔；PBS沖洗收集細(xì)胞。于離心管加入淋巴細(xì)胞分離液5 mL，將細(xì)胞懸液加至分離液上層，密度梯度離心，直至骨髓腔液體分為四層。用吸管輕吸云霧狀的白膜層即單個核細(xì)胞層，用含5%胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)，取培養(yǎng)7 d的EPCs進(jìn)行實驗。

1.2.3EPCs的鑒定取培養(yǎng)第7天原代EPCs，經(jīng)DiI-acLDL（2.4 μg/mL）及FITC-UEA-1（10 μg/mL）孵育，PBS洗滌后，在熒光顯微鏡下鑒定。

1.2.4EPCs的增殖用0.25%胰酶將 EPCs消化成單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)空白對照和6個復(fù)孔，48 h后加入MTT溶液培養(yǎng)4 h，吸棄上清后加入二甲基亞砜，在酶標(biāo)儀于570 nm處測定各孔的吸光度值，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.5EPCs小管的形成將Matrigel膠4℃過夜凍融，在層流超凈臺上，Matrigel包被48孔培養(yǎng)板，并放置37℃，5%CO2環(huán)境下聚合30 min。用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化并收集貼壁細(xì)胞，每孔加入500 μL細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。顯微鏡下觀察管腔樣結(jié)構(gòu)并拍照，計數(shù)高倍鏡下5個視野的管腔長度，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6EPCs的遷移取培養(yǎng)7 d的小鼠骨髓EPCs，用0.25%胰酶 （含0.02%EDTA）消化并收集細(xì)胞。將100 μL細(xì)胞懸液緩慢加入Transwell小室的上室。將下室加入500 μL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，檢測時移去上室培養(yǎng)液，100%甲醇固定，2.5 g/L結(jié)晶紫置于37℃暖箱染色30 min，顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)高倍鏡下5個視野的遷移細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1骨髓EPCs的形態(tài)

分離的單個核細(xì)胞72 h后呈梭形生長。第7天時，細(xì)胞生長旺盛，部分呈集落生長，中央細(xì)胞密集且呈復(fù)層生長，并由中央向外周伸展出梭形、紡錘形細(xì)胞，近似單層生長。培養(yǎng)14 d，細(xì)胞融合成鋪路石內(nèi)皮樣細(xì)胞。見圖1。

圖1　骨髓來源小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)（100×）

2.2EPCs的鑒定

將培養(yǎng)的EPCs進(jìn)行DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙熒光染色，UEA-1陽性顯示綠色熒光，ac-LDL陽性顯示紅色熒光，EPCs雙熒光陽性，顯示橙黃色。見圖2（封三）。

2.31型糖尿病小鼠EPCs的增殖

采用MTT比色法檢測EPCs的增殖能力，1型糖尿病小鼠培養(yǎng)的EPCs增殖明顯減少 （P＜0.05），較正常對照組減少約40%。見圖3。

與Control比較，*P＜0.05，n=4圖3　1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力

2.41型糖尿病小鼠EPCs小管的形成

用Matrigel建立小管形成的體外模型，計算形成的管腔長度。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，1型糖尿病小鼠的EPCs小管形成能力顯著減弱（P＜0.05）。見圖4。

與Control比較，*P＜0.05；n=4圖4　1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞小管的形成能力（100×）

2.51型糖尿病小鼠的EPCs遷移能力

用改良的Boyden小室法檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，糖尿病小鼠EPCs的遷移數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。見圖5（封三）。

3　討論

隨著經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展和人們生活方式的快速轉(zhuǎn)變，我國糖尿病患者迅速增多，目前成人糖尿病患病率高達(dá)11.6%，保守估計約1.139億人，已成為世界第一糖尿病大國［9］。糖尿病血管病變是糖尿病多種并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，采用EPCs替代受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，摻入受損的血管進(jìn)而修復(fù)血管功能，近年成為一個新的有希望的治療策略。

EPCs主要定位于骨髓，在循環(huán)外周血中EPCs僅占單核細(xì)胞的0.1%［10］。骨髓中的EPCs含量相對豐富，增殖能力強(qiáng)，而外周血的EPCs數(shù)量很少，糖尿病患者的EPCs數(shù)量則更少。由于糖尿病EPCs的數(shù)量稀少，增殖能力減弱，成功培養(yǎng)糖尿病EPCs成為一個難點。因此本研究對從糖尿病小鼠的骨髓中分離培養(yǎng)出來的EPCs進(jìn)行分析。

目前EPCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)未完全一致。一般通過細(xì)胞的形態(tài)、功能和表型多方面指標(biāo)鑒定EPCs。綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)，常用的鑒定方法是EPCs培養(yǎng)早期呈紡錘形，晚期呈鋪路石內(nèi)皮樣，可攝取植物凝集素（UEA-1）和乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL），并表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和祖細(xì)胞的混合表型［11］。

本研究首先采用STZ建立1型糖尿病小鼠模型，STZ是N-乙酰葡糖胺的類似物，它由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸送到胰腺β細(xì)胞，通過抑制β細(xì)胞的N-乙?；?D-氨基葡萄糖苷酶的活性造成β細(xì)胞毒性，導(dǎo)致胰島素缺乏［12］。C57/B6小鼠是STZ-誘導(dǎo)1型糖尿病的敏感品系小鼠，產(chǎn)生持續(xù)的高血糖癥與組織學(xué)病變發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于各種糖尿病并發(fā)癥的研究［13-14］。首先將分離的骨髓單個核細(xì)胞用內(nèi)皮細(xì)胞特定的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，經(jīng)DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙染法，雙染細(xì)胞占貼壁細(xì)胞總數(shù)的80%以上，證實絕大多數(shù)貼壁細(xì)胞為EPCs，細(xì)胞形態(tài)和免疫鑒定都表明我們成功分離培養(yǎng)糖尿病小鼠骨髓EPCs。建立1型糖尿病小鼠后，本研究采用密度梯度離心方法分離獲得糖尿病小鼠骨髓的單個核細(xì)胞，采用纖連蛋白黏附，用含有血管內(nèi)皮生長因子等多種生長因子的EGM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。第7天左右，細(xì)胞呈紡錘形，部分呈集落生長，中央細(xì)胞密集且呈復(fù)層生長，并由中央向外周伸展出梭形細(xì)胞。培養(yǎng)14 d，細(xì)胞融合成鋪路石內(nèi)皮樣細(xì)胞。并經(jīng)FITC-UEA-1和DiI-acLDL熒光雙染法證實成功分離培養(yǎng)糖尿病小鼠骨髓EPCs。

EPCs具有增殖、遷移和血管形成能力，在環(huán)境誘導(dǎo)下骨髓中的EPCs可以自發(fā)地動員并結(jié)合到內(nèi)皮缺損或缺血部位，在血管內(nèi)皮的修復(fù)和血管新生中都起著重要作用［15-17］。然而大量臨床研究報道，糖尿病患者的EPCs數(shù)量減少，并且血管原性功能發(fā)生障礙［18-19］。Loomans等［20］報道1型糖尿病患者比正常對照外周血中EPCs數(shù)目平均降低44%，而且EPCs數(shù)目減少的程度與HbA1C的水平呈正相關(guān)。Sorrentino等［21］將健康受試者和2型糖尿病患者分離的EPCs移植入裸鼠的頸動脈，糖尿病EPCs不能修復(fù)受損的動脈內(nèi)皮層，而正常EPCs可改善受損的內(nèi)皮。

本實驗檢測了1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的體外功能。實驗結(jié)果顯示，糖尿病小鼠EPCs的增殖減少，遷移和小管形成能力顯著下降，這與臨床的研究結(jié)果相一致。足夠的數(shù)量和正常的功能是影響EPCs參與修復(fù)內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵因素。而糖尿病患者循環(huán)EPCs數(shù)量顯著減少，功能發(fā)生障礙，無法修復(fù)高血糖導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷。因此進(jìn)一步闡明糖尿病EPCs功能障礙的機(jī)制，找到改善EPCs功能的策略，有望用于預(yù)防和治療糖尿病血管并發(fā)癥。

［1］Altabas V，Altabas K，Kirigin L.Endothelial progenitor cells （EPCs）in ageing and age-related diseases:how currently availabletreatmentmodalitiesaffectEPCbiology，atherosclerosis，and cardiovascular outcomes？［J］.Mech Ageing Dev，2016.pii:S0047-6374（16）30014-8.doi:10.1016/j.mad.2016. 02.009.

［2］King TF，Mcdermott JH.Endothelial progenitor cells and cardiovascular disease［J］.J Stem Cells，2014，9（2）:93-106.

［3］Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］.Science，1997，275（5302）:964-967.

［4］Maiorino MI，Bellastella G，Petrizzo M，et al.Circulating endothelial progenitor cells in type 1 diabetic patients with erectile dysfunction［J］.Endocrine，2015，49（2）:415-421.

［5］Menegazzo L，Albiero M，Avogaro A，et al.Endothelial progenitor cells in diabetes mellitus［J］.Biofactors，2012，38（3）: 194-202.

［6］劉毅，李志樑，江騰春，等.黃芪多糖對2型糖尿病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（34）:8-10.

［7］陸慶明，邸春霞，張榮慶，等.原發(fā)性高血壓條件下骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的變化［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（7）:20-21.

［8］沈永斌，李偉東，劉焱喆，等.大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，47（2）: 130-134.

［9］Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults［J］.JAMA，2013，310（9）:948-959.

［10］Asahara T，Kawamoto A.Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287（3）:C572-C579.

［11］Sukmawati D，Tanaka R.Introduction to next generation of endothelial progenitor cell therapy:a promise in vascular medicine［J］.Am J Transl Res，2015，7（3）:411-421.

［12］Kolb H.Mouse models of insulin dependent diabetes:lowdose streptozocin-induced diabetes and nonobese diabetic（NOD）mice［J］.Diabetes Metab Rev，1987，3（3）: 751-778.

［13］Islam MS.Animal models of diabetic neuropathy:progress since 1960s［J］.J Diabetes Res，2013，2013:149452.

［14］Xiao Q，Hou N，Wang YP，et al.Impaired sonic hedgehog pathway contributes to cardiac dysfunction in type 1 diabetic mice with myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res，2012，95（4）:507-516.

［15］孫云鵬.肝細(xì)胞生長因子對體外培養(yǎng)冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的影響［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，14（11）:890-893.

［16］李亮，梁亞州，朱飛云，等.內(nèi)皮祖細(xì)胞與冠狀動脈支架置入術(shù)后再內(nèi)皮化的研究進(jìn)展［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（34）:191-194.

［17］周碧蕓.APL及EPCs對老年2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的診斷價值［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（12）:144-145，157.

［18］Georgescu A，Alexandru N，Constantinescu A，et al.The promise of EPC-based therapies on vascular dysfunction in diabetes［J］.Eur J Pharmacol，2011，669（1-3）:1-6.

［19］Reinhard H，Jacobsen PK，Lajer M，et al.Multifactorial treatment increases endothelial progenitor cells in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetologia，2010，53 （10）:2129-2133.

［20］Loomans CJ，de Koning EJ，Staal FJ，et al.Endothelial progenitor cell dysfunction:a novel concept in the pathogenesis of vascular complications of type 1 diabetes［J］. Diabetes，2004，53（1）:195-199.

［21］Sorrentino SA，Bahlmann FH，Besler C，et al.Oxidant stress impairs in vivo reendothelialization capacity of endothelial progenitor cells from patients with type 2 diabetes mellitus:restoration by the peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma agonist rosiglitazone［J］.Circulation，2007，116（2）:163-173.

Culture and biological function study of bone marrow endothelial progenitor cells in type 1 diabetic mice

QIN YuanCAI YiZHANG ManZHAO Li
Department of Pharmacology，Guangzhou Snake Venom and Biotoxin Research Institute，Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou511436，China

R587.1

A

1673-7210（2016）08（a）-0008-04

2016-04-20本文編輯:任念）

廣東省自然科學(xué)基金項目（2016A030310271）；廣州醫(yī)科大學(xué)科學(xué)科研項目（2013C2205）。

覃媛（1978.2-），女，博士，實驗師；研究方向:心血管藥理。

趙莉（1979.1-），女，博士；研究方向:心血管及腫瘤藥理。