王振斌，王　晴，劉加友，陳兵兵

葛根汁發(fā)酵前后營養(yǎng)及風味成分變化研究

王振斌，王晴，劉加友，陳兵兵

（江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

采用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵葛根汁，通過對葛根汁發(fā)酵過程中的總黃酮、γ-氨基丁酸（GABA）、游離氨基酸、有機酸、乙醇和揮發(fā)性化合物等組分進行分析檢測，探究了發(fā)酵前后營養(yǎng)與風味成分的變化規(guī)律。結果表明，發(fā)酵6 d葛根汁總黃酮含量（0.71 g/L）比葛根汁（0.59 g/L）提高了17.72%；GABA質量濃度（3.64 g/L）比葛根汁（0.98 g/L）增加了279.17%；必需氨基酸總量比葛根汁增加了65.58%；乙醇產率下降，乳酸濃度增加；發(fā)酵產品中的風味物質如醛類、醇類和酯類等的含量比葛根汁有所提高。

葛根汁；營養(yǎng)；風味成分；發(fā)酵

葛根（Radix puerariae）為豆科植物的塊根，又叫甘葛、粉葛、黃葛根、葛麻茹，主要分布在我國的四川、安徽、江蘇等地，資源豐富，具有特有的清香［1］。葛根作為一種藥食兩用植物，其營養(yǎng)豐富，具備人體必需的多種氨基酸、維生素和有機酸，特別是葛根中的異黃酮，具有降血壓、解酒保肝和和抗氧化的功能，已成為國內外藥理學研究的熱點。

目前國內對葛根的加工主要以獲得葛根淀粉為主，葛根黃酮等保健功能成分的流失，造成資源的浪費。對葛根飲料的開發(fā)主要分為兩個方向：一是以葛根水提物為原料，對水提物適當?shù)恼{味和穩(wěn)定性調配制得；二是以葛根為原料，通過加酶進行水解，然后以酶解液為原料，這兩種方法制備簡單，未能對葛根中的有效成分進行提取，造成資源的浪費。乳酸菌和酵母菌是益生菌，通過發(fā)酵法不僅能夠提取葛根中的黃酮，還能增加保健功能因子γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）含量，賦予發(fā)酵產品新的保健功能，而且還可以相互作用形成發(fā)酵產品特有的風味。

本研究以葛根為原料，采用乳酸菌和酵母菌等益生菌發(fā)酵，利用氣相色譜、液相色譜、氨基酸分析以及氣質聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）等檢測方法對發(fā)酵前后葛根汁的葛根素、γ-氨基丁酸（GABA）、氨基酸、有機酸、乙醇和揮發(fā)性化合物進行分析，探究發(fā)酵前后葛根汁營養(yǎng)和成為成分的變化，不僅為我國葛根飲料的研制提供參考，同時也為葛根產業(yè)的高值化和葛根資源的開發(fā)與利用具有重要的社會意義和經(jīng)濟意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

葛根丁：安徽金龍山葛根有限公司。

1.1.2菌種

菌株H2和H6為自主分離篩選的產GABA的乳酸菌，經(jīng)16S rDNA鑒定，分別為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）T16和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）7-2；酵母菌：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3主要試劑

葛根素標準品（批號：20130610，純度＞98%）：上海金穗生物科技有限公司；γ-氨基丁酸標準品（純度99%）：上海源葉生物科技公司；乙醇（色譜級）：美國TEDIA公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、磺基水楊酸、磷酸氫二銨、磷酸、酒石酸、草酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸、抗壞血酸、檸檬酸、乙酸等（均為分析純）：中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑有限公司。

1.2儀器與設備

PHS-3TC型酸度計：上海天達儀器有限公司；DCL-200邁克電磁爐：邁克股份有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技儀器有限公司；7200型分光光度計：上海天達儀器有限公司；S433D氨基酸分析儀：德國Sykam公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；HP6890氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；GC-5890氣相色譜儀：美國惠普公司。

1.3實驗方法

1.3.1葛根汁的制備工藝流程及操作要點

操作要點：選取無斑點、無蟲蛀的葛根丁，經(jīng)粉碎機粉碎后過100目篩得葛根粉，然后將葛根粉與水按質量比1∶10混勻后打漿，蒸煮2 h冷卻室溫，然后采用六層紗布過濾，棄去濾渣得到葛根汁，備用。

葛根汁的發(fā)酵：將葛根汁用1 mol/L的碳酸氫鈉溶液調整初始pH 5.55，分別添加3.05%谷氨酸鈉和10%的紅糖，放入1 L的三角瓶，然后將活化的乳酸菌和酵母菌液體種（OD=2.53）分別接種到葛根汁中，接種量0.5%（菌株H2為0.13%，菌株H6為0.06%，酵母菌0.31%）用封口膜封口，然后施加超聲強度0.16 W/cm3的定頻超聲波，超聲88 min取出，靜置發(fā)酵，30℃條件下發(fā)酵6 d，殘?zhí)橇俊?.2 g/L，結束發(fā)酵。

1.3.2總黃酮含量的測定

葛根素標準曲線的繪制［5］：精密稱取葛根素標準品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用少量乙醇溶解并加水定容至刻度，搖勻，即得0.1mg/mL的葛根素對照品溶液。量取葛根素對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，再加蒸餾水至刻度，搖勻，以蒸餾水為空白對照，在波長250 nm處測定吸光度值，實際值為測定值減去空白值。以葛根素質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標作標準曲線，得標準曲線回歸方程y=50.286x-0.007 8，相關系數(shù)R2=0.998 7。按照回歸方程計算葛根樣品中總黃酮含量。

1.3.3乙醇含量的測定

乙醇含量根據(jù)參考文獻［6-7］由氣相色譜法測定，并稍做修改。氣相色譜條件：HP-INNOWAX毛細管柱（30 m× 0.25 mm）；氫離子火焰檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）；檢測器溫度分別為240℃和260℃。柱溫程序升溫：初溫100℃保持1min，以15℃/min的速率升溫至220℃保持5 min。氮氣（N2）作為載氣，氮氣、氫氣和空氣的流速分別為290 mL/min、170 mL/min和290 mL/min。以乙醇的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準乙醇標準曲線。經(jīng)過一元線性回歸得乙醇標準曲線回歸方程y= 583.16x-119.23，相關系數(shù)R2=0.998 1。

葛根樣品乙醇含量的測定：取發(fā)酵葛根汁，3000r/min的條件下離心10min，取上清液稀釋到適宜濃度，過0.22μm微孔濾膜，以0.2 μL的進樣量注入氣相色譜進樣口，根據(jù)乙醇的峰面積，按照得到的回歸方程計算乙醇的含量。

1.3.4γ-氨基丁酸的測定

γ-氨基丁酸（GABA）采用高效液相色譜法，參照文獻［8］，并稍做修改：

（1）衍生試劑的配制：精確稱取鄰苯二甲醛（OPA）0.1 g、β-巰基乙醇130 μL溶解在1 mL乙腈和0.5 mL甲醇中，然后加入用0.5mol/L硼酸溶液定容至20mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）硼酸緩沖液的配制：取硼酸0.62 g和KOH 0.52 g溶于20 mL蒸餾水中；

（3）流動相A（乙酸鈉緩沖液）的配制：取無水乙酸鈉8.0 g溶于1 000 mL雙蒸水，加入三乙胺220 μL，用5%冰醋酸調pH值為7.2，再加入5mL的四氫呋喃，混勻后過0.22 μm過濾膜；

（4）流動相B的配制：取8.0 g乙酸鈉，用雙蒸水定容至1 000 mL，然后用2%的乙酸溶液調節(jié)pH為7.2，再按乙酸鈉溶液∶乙腈∶甲醇=1∶2∶2（V/V）混合后過0.22 μm針孔過濾膜；

（5）樣品的衍生：吸取衍生試劑和預處理后的發(fā)酵汁按照1∶1的比例混合，室溫反應5 min，取20 μL進樣；

（6）高效液相色譜分析：采用C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm），A、B混合流動相流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長338 nm，梯度洗脫條件見表1。

表1　高效液相色譜洗脫程序Table 1 Elution program of HPLC

（7）標準曲線的繪制與樣品分析

精確稱量GABA標準品10 mg，用去離子水定容至100 mL，然后精確量取5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL的標準品溶液，分別加入495 mL、490 mL、480 mL、470 mL、450 mL的雙蒸水，衍生測定，然后按照峰面積和GABA濃度繪制標準曲線。GABA質量濃度（x）在0～5.0g/L的范圍內與峰面積（y）的線性方程為：y=519 266.54x-17 195.85，相關系數(shù)R2=0.998 0。按照標準曲線回歸方程根據(jù)樣品的峰面積計算樣品中的GABA含量。

1.3.5游離氨基酸含量的測定

參照文獻［9-11］，采用SykamS433D氨基酸分析儀測定。

1.3.6有機酸含量的測定

有機酸含量的測定采用高效液相色譜法，參照國標GB/T 5009.157—2003《食品中有機酸的測定》中的方法，以峰面積（y）的平均值為縱坐標，有機酸質量濃度（x）為橫坐標，繪制有機酸標準曲線，經(jīng)過一元線性回歸得出各有機酸標準曲線回歸方程如表2所示。

表2　有機酸回歸方程Table 2 Regressions equation of organic acids

1.3.7揮發(fā)性成分的測定

（1）頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）方法

精確量取5 mL樣品加入15 mL的頂空瓶，將固相萃取頭插入瓶中，50℃保持10min，固相萃取頭與葛根酵素發(fā)酵汁液面保持1.5 cm的距離，磁力攪拌速度為100 r/min，萃取30 min后進樣。

2）GC-MS參數(shù)條件

氣相色譜（GC）條件：毛細管色譜柱DB-WAX（60 m× 0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250℃，固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）插入進樣孔解吸3 min；始溫40℃，保持2 min，以5℃/min升溫至80℃，再以8℃/min升溫至180℃，再以15℃/min升至240℃，保持8 min；載氣：氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流。

質譜（MS）條件：接口溫度250℃，離子源溫度200℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍33～450 amu。

（3）揮發(fā)性化合物定性定量方法

采用GC-MS工作站軟件對照美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫進行分析，通過譜庫檢索和揮發(fā)性成分的質譜碎片信息、保留指數(shù)、保留時間等進行定性分析；采用面積歸一法進行相對含量統(tǒng)計。

1.3.8數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 16.0和Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差別（least significant difference，LSD）法。

2　結果與分析

2.1葛根汁中總黃酮含量變化

根據(jù)1.3.2實驗方法測定葛根發(fā)酵汁中葛根黃酮的含量，結果見圖1。

圖1　葛根汁發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化Fig.1 Changes of total flavonoids contents during Kudzu root juice fermentation

由圖1可知，在乳酸菌和酵母菌的作用下，葛根發(fā)酵汁的總黃酮含量不斷增加，隨后達到平衡。發(fā)酵第6天總黃酮含量（0.711 g/L）與葛根汁總黃酮含量（0.585 g/L）相比提高了17.72%，本研究結果與劉改霞等［12-13］的研究結果一致，說明微生物發(fā)酵能夠提高葛根黃酮的含量。發(fā)酵葛根汁中黃酮含量的增加，分析其原因，一方面可能是乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中分泌多種胞外酶，它們能夠破壞細胞壁的顯微結構，促進黃酮的溶出；另一方面也有可能是微生物在發(fā)酵的過程中產生一些黃酮類化合物。

2.2葛根汁中乙醇含量的變化產生

根據(jù)1.3.3實驗方法測定葛根發(fā)酵汁中乙醇的含量，結果見圖2。

圖2　葛根汁發(fā)酵過程中乙醇含量的變化Fig.2 Changes of ethanol contents during Kudzu root juice fermentation

由圖2可知，葛根發(fā)酵汁中的乙醇含量在發(fā)酵第1天開始出現(xiàn)增加，到第4天達到最大值3.84 g/L。其原因是接入乳酸菌和酵母菌后，由于發(fā)酵汁中營養(yǎng)和氧氣充足，酵母菌開始大量增殖，乙醇增加不顯著；酵母菌和乳酸菌完成增殖后，酵素中的氧氣含量降低，酵母的厭氧發(fā)酵開始，乙醇含量開始增加，但隨著發(fā)酵的進行，一方面還原糖被不斷的消耗殆盡，酵母菌無氧發(fā)酵減緩，另一方面代謝積累的乙醇抑制了酵母厭氧發(fā)酵，造成酵母轉化乙醇的速率降低，乙醇含量有所下降。

2.3 GABA含量的變化

根據(jù)1.3.4實驗方法測定葛根發(fā)酵汁中GABA的含量，結果見圖3。

圖3　葛根汁發(fā)酵過程中GABA含量的變化Fig.3 Changes of GABA contents during Kudzu root juice fermentation

由圖3可知，GABA的含量隨發(fā)酵的進行呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢。在發(fā)酵的初始階段，由于谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）的活性較高，轉化L-谷氨酸的能力較強，在發(fā)酵第1天后，發(fā)酵汁的乳酸菌和酵母菌完成了增殖，胞內的GAD含量和活性增加，使得發(fā)酵汁中γ-氨基丁酸的含量增加迅速，并在第4天達到最大值3.64g/L。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵汁的還原糖減少、GABA的積累和菌株衰亡期的到來，都影響乳酸菌產GABA的能力，因此在4 d以后發(fā)酵汁的GABA的含量趨于穩(wěn)定。

2.4游離氨基酸含量的變化

根據(jù)1.3.5實驗方法測定發(fā)酵葛根汁中氨基酸的含量，結果（見表3）可知，葛根汁中含有16種游離氨基酸，其中包括5種人體必需氨基酸，10種非必需氨基酸。游離氨基酸總量約4.599 mg/mL，其中天冬氨酸含量最高，其次是丙氨酸。葛根汁中必需氨基酸占總氨基酸的25.47%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為33.69。

微生物的發(fā)酵使葛根汁中一些游離氨基酸含量略有增加，其中異亮氨酸含量增加最明顯，增加量為305.02μg/mL，必需氨基酸的含量增加2232.0μg/mL，增加率達到65.58%。天冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬酰胺的含量降低，其他氨基酸含量上升，說明微生物在葛根汁中生長時消耗部分氨基酸，同時也會產生部分氨基酸。

表3　發(fā)酵葛根汁中游離氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acid in Kudzu root juice fermentation μg/mL

結果表明葛根發(fā)酵汁中游離氨基酸除了具有營養(yǎng)功能和促進機體消化外，本身也會產生一定的風味，如纈氨酸、蘇氨酸等通過微生物轉化產生特征性風味物質乙醛。

2.5有機酸含量的變化

根據(jù)1.3.6實驗方法測定葛根發(fā)酵汁中氨基酸的含量，結果見表4。

表4　葛根汁中主要有機酸含量檢測結果Table 4 Determination results of main organic acid contents in Kudzu root juice mg/mL

乳酸菌發(fā)酵產生的有機酸可改善產品的風味，是發(fā)酵產品重要的風味物質。由表4可以看出，葛根汁中有機酸以酒石酸為主，而葛根酵素發(fā)酵汁則以乳酸為主。發(fā)酵前后有機酸種類和含量發(fā)生了較大的變化。在乳酸菌發(fā)酵過程中乳酸是其產生的主要有機酸，乳酸的酸味溫和適中，口感好，也是發(fā)酵葛根汁的特征性風味酸。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的葛根酵素發(fā)酵汁中含有乙酸，可能是不同的生物化學途徑的結果，如乳酸的降解［14］、檸檬酸代謝［15］和異型乳酸發(fā)酵。琥珀酸由乳酸菌的檸檬酸代謝產生并且與乙酸增多有關，在腸道和植物源的乳酸菌中由檸檬酸代謝產生琥珀酸很常見［16］。檸檬酸含量明顯降低，可能與檸檬酸代謝生成2，3-丁二酮、乙酸等有關。

2.6揮發(fā)性成分的變化

根據(jù)1.3.7實驗方法測定發(fā)酵葛根汁中揮發(fā)性化合物，結果見表5。

表5　葛根汁中揮發(fā)性化合物檢測結果Table 5 Determination results of the volatile compounds in Kudzu root juice

續(xù)表

由表5可知，葛根汁和發(fā)酵葛根汁的揮發(fā)性香氣成分在種類和含量上均具有較大差異，但主要香氣物質為醇類、酯類和酸類。葛根汁中檢出28種揮發(fā)性化合物，包括醇類（3種）、酯類（2種）、酸類（8種）、烷烴類（6種）、醛酮類（2種）、醚類（4種）、其他（3種），其中含量最高的是烷烴類化合物。發(fā)酵葛根汁中共檢出25種揮發(fā)性化合物，包括醇類（8種）、酯類（5種）、醛酮類（2種）、酸類（3種）、醚類（3種）、其他（4種），其中醇類含量最高。

葛根汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，醇類、酯類和有機酸的含量和種類明顯高于葛根汁。乳酸菌的代謝產生有機酸，如辛酸、葵酸等，有機酸是保持果酒中酒體平衡和口感清爽特性的主要物質，能使發(fā)酵葛根汁帶有新鮮的水果香，修飾發(fā)酵葛根汁的滋味和口感，如辛酸，具有果味、桃子味、草莓味、菠蘿味、糖果味、焦糖味、香水味等多種風味。酵母的厭氧發(fā)酵會產生一些醇類化合物，如苯乙醇、乙醇等。苯乙醇，香味獨特，具有玫瑰香、紫羅蘭香、茉莉花香等多樣風味［17］；乙醇具有特殊的、令人愉快的香味。另外乳酸菌和酵母菌發(fā)酵會產生一些酯類化合物，如辛酸乙酯、葵酸已酯。大多數(shù)酯類化合物具有花、果香氣，如辛酸乙酯具有令人愉快的花果香氣、杏子香氣［18］；癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣［19］。

3　結論

通過對發(fā)酵葛根汁中的總黃酮、乙醇、GABA、游離氨基酸、有機酸和揮發(fā)性化合物等組分進行分析檢測，研究了發(fā)酵前后營養(yǎng)與風味成分的變化規(guī)律。結果表明，發(fā)酵6 d葛根汁總黃酮含量（0.711 g/L）比葛根汁（0.585 g/L）提高了17.72%；GABA質量濃度（3.641g/L）比葛根汁（0.983 g/L）增加了279.17%；必需氨基酸總量比葛根汁增加了65.58%；乙醇產率下降，乳酸濃度增加；發(fā)酵產品中的風味物質如醛類、醇類和酯類等的含量比葛根汁有所提高。

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Changes of nutrition and flavor components before and after Kudzu root juice fermentation

WANG Zhenbin，WANG Qing，LIU Jiayou，CHEN Bingbing
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Kudzu root juice was fermented by lactic acid bacteria and yeast.By the analysis and detection of the total flavonoids，γ-aminobutyric acid（GABA），free amino acid，organic acid，ethanol and volatile components during the Kudzu root juice fermentation，the change rule of the nutrition and flavor components before and after fermentation was researched.The results showed that the total flavonoids content（0.71 g/L），GABA content（3.64 g/L）and total essential amino acids content in Kudzu root juice fermented for 6 d were 17.72%，279.17%and 65.58%higher than the total flavonoids content（0.59 g/L），GABA content（0.98 g/L）and total essential amino acids content in Kudzu root juice，respectively.The ethanol yield decreased，the lactic acid content increased，and volatile components（aldehydes，alcohols and esters）increased after the fermentation.

Kudzu root juice；nutrition；flavor components；fermentation

TS275.4

0254-5071（2016）07-0093-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.020

2016-01-13

國家優(yōu)勢學科項目（1033000006）；江蘇鎮(zhèn)江市科技支撐計劃（No.NY2014016）

王振斌（1975-），男，教授，博士，研究方向為功能成分提取。