張占軍，楊小生（1.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽550002；2.揚州市職業(yè)大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009）

響應面法優(yōu)化土黨參多糖的提取工藝及其神經營養(yǎng)活性研究

張占軍1，2，楊小生1，*
（1.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽550002；2.揚州市職業(yè)大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009）

對土黨參多糖（CJP）的提取條件，分離純化及其理化性質進行了研究，并研究了土黨參多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用。通過單因素實驗及響應面優(yōu)化實驗，土黨參多糖最佳提取條件確定為提取溫度67℃、提取時間52 min和液料比17∶1 mL/g。通過DEAE-52纖維素柱層析分離，葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析純化，得到兩種土黨參多糖CJPH和CJPN。采用化學分析方法分析了土黨參多糖的總糖、蛋白質、糖醛酸及硫酸基含量。通過高效液相凝膠滲透色譜法進行純度鑒定和相對分子質量測定表明，CJPH和CJPN為均一多糖，其重均分子量Mw分別為3923 u 和7215 u。通過氣相色譜法對其單糖組成進行了分析，采用紅外光譜研究了其結構特征。通過PC12細胞培養(yǎng)表明，CJPH和CJPN均具有神經營養(yǎng)活性。研究表明，制備的土黨參多糖能明顯修復損傷的神經細胞，具有一定的開發(fā)利用價值。

多糖，響應面，優(yōu)化，分離，純化，理化性質，生物活性

土黨參（Campanumoea javanica Blume）為桔?？平疱X豹屬植物，又名野黨參、奶參、白洋參、對月參、土參、柴黨參、浮萍參、川人參等，多生于山坡草地、灌叢中。廣泛分布于貴州松桃、遵義、畢節(jié)、興義、織金等地苗鄉(xiāng)以及我國南部和西南部分地區(qū)。民間以其根入藥，有補氣、止血、通乳的作用，用于虛勞內傷，肺虛咳嗽，脾虛泄瀉，乳汁不多，小兒遺尿等癥［1］。多糖作為一類碳水化合物，包括若干通過糖苷鍵連接的單糖，具有多種生物活性。近年來，由于其低毒性及廣泛的治療屬性，如抗氧化［2］、抗腫瘤［3-4］、免疫調節(jié)［5-6］、抗炎［7-8］和降血糖［9-10］等活性，引起人們極大關注。土黨參中多糖含量較高，其鮮品中多糖的含量可達16.40%～17.73%，經預處理后，熱水浸提土黨參多糖提取率可達28.05%［11］。此外，近年來對土黨參多糖的藥理研究表明，土黨參多糖對小鼠腦缺血損傷具有保護作用［12］，且能夠提高小鼠耐缺氧的能力［13］，以及具有改善小鼠學習記憶能力的作用［14］，并對小鼠具有抗疲勞作用［15］，因此具有較高的開發(fā)利用價值。

對土黨參資源進行合理利用，本工作擬采用水煮醇沉法從土黨參中提取水溶性多糖，并通過響應面法優(yōu)化提取工藝條件，同時擬采用化學分析方法分析土黨參多糖的總糖、蛋白質、糖醛酸及硫酸基含量，通過高效液相凝膠滲透色譜法進行純度鑒定和相對分子質量測定，通過氣相色譜法對其單糖組成進行分析，采用紅外光譜研究其結構特征。并擬研究土黨參多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用，從而為土黨參這一資源的進一步研究開發(fā)提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土黨參藥材 購自貴州遵義，經貴陽中醫(yī)學院陳德媛教授鑒定為桔?？平疱X豹屬植物土黨參（Campanumoea javanica Bl.）；大鼠嗜鉻細胞瘤PC-12細胞株 由中國典型培養(yǎng)物中心提供；馬血清和小牛血清 購于美國Hyclone公司；神經生長因子（Nerve Growth Factor，NGF），DEAE-纖維素-52凝膠與Sephadex G-100 購于美國Sigma公司；牛血清白蛋白、葡萄糖醛酸、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、Pullulan等標準品 購于Sigma公司；其他所用試劑 均為分析純。

H8453紫外可見分光光度儀 美國惠普公司；BRUKER-VECTOR22型傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克光譜儀器；HP 1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有示差折光檢測器和數據處理系統(tǒng)） 美國惠普公司；GC-16型氣相色譜儀 日本島津公司；722S型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；HL-2B恒流泵與DBS-100A型自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠；Alpha 1-2型冷凍干燥機 英國LABCONCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 土黨參經切碎烘干后粉碎，取過60目篩后粉末加90%乙醇回流提取2次，每次1 h，固液分離后，殘渣經干燥得預處理土黨參樣品，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土黨參多糖的提取工藝流程 取預處理土黨參樣品10 g置圓底燒瓶中，加一定蒸餾水于特定溫度下加熱浸提一定時間，提取結束后離心（5000 r/min，10 min），收集上清液，殘渣重復提取1次。上清液合并后減壓濃縮至一定體積，加乙醇至最終體積分數為80%，5000 r/min離心10 min，沉淀物依次用無水乙醇、乙醚、丙酮各洗滌2次，干燥后即得土黨參粗多糖（CJP）。

1.2.3 土黨參多糖得率的計算 按以下公式計算土黨參多糖得率：

多糖得率Y（%）=WE/WP×100

其中：WE為的粗提取物的質量（g）；WP為每次實驗中使用的預處理樣品質量（g）。

1.2.4 單因素實驗 應用水提醇沉法提取土黨參多糖，分別考察不同提取溫度、提取時間和液料比對土黨參多糖得率的影響。

1.2.4.1 提取溫度對土黨參多糖得率的影響 取預處理土黨參樣品5份，每份約10 g，各加蒸餾水200 mL，分別在50、60、70、80、90℃五個不同溫度下，通過水浴鍋加熱攪拌提取45 min，各重復提取一次后合并濾液，制得土黨參粗多糖后計算土黨參多糖得率。

1.2.4.2 提取時間對土黨參多糖得率的影響 取預處理土黨參樣品5份，每份約10 g，各加蒸餾水200 mL，在70℃下通過水浴鍋加熱攪拌提取，提取時間分別設置為15、30、45、60、75 min，各重復提取一次后合并濾液，制得土黨參粗多糖后計算土黨參多糖得率。

1.2.4.3 液料比對土黨參多糖得率的影響 取預處理土黨參樣品5份，每份約10 g，分別加入蒸餾水100、150、200、250、300 mL，在70℃下通過水浴鍋加熱攪拌提取45 min，各重復提取一次后合并濾液，制得土黨參粗多糖后計算土黨參多糖得率。

1.2.5 響應面優(yōu)化實驗 根據單因素實驗確定的各變量范圍，采用Design-Expert軟件，進行三因素三水平Box-Behnken實驗設計，表1列出了各因素的實驗水平及編碼。根據單因素實驗確定的各變量范圍，選取提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C）3個因素作為響應變量，以土黨參多糖得率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，優(yōu)化土黨參多糖提取工藝，以1、0、-1分別代表自變量的三個水平，實驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面實驗設計因素和水平表Table1 Variables and levels in the three-level，three-variable Box-Behnken experimental design

1.2.6 土黨參粗多糖的分離純化

1.2.6.1 土黨參多糖的DEAE-52纖維素柱色譜 采用DEAE-52-纖維素交換柱色譜法對土黨參粗多糖進行初步分離純化，按照已經報道過的方法［16］。

1.2.6.2 土黨參多糖的葡聚糖凝膠色譜法純化 經DEAE-52纖維素初步純化的產品用葡聚糖凝膠Sephadex色譜柱法進行進一步純化。

1.2.7 土黨參多糖的基本理化性質分析

1.2.7.1 總糖含量測定 樣品均經過預處理，其中單糖及寡糖含量已甚微，所以再測定還原糖意義不大，故本實驗直接采用苯酚-硫酸法測定總糖含量。

1.2.7.2 蛋白質含量測定 多糖樣品中蛋白質含量的測定，采用Zhang等［17］報道的考馬斯亮藍法并略作修改。

1.2.7.3 糖醛酸含量測定 多糖樣品中糖醛酸含量的測定，采用Wang等［18］報道的硫酸-間羥聯苯法略作修改。

1.2.7.4 硫酸基含量測定 多糖樣品中硫酸基含量的測定，參照Zhang等［17］報道的氯化鋇-明膠比色法并略作修改。

1.2.7.5 純度鑒定及相對分子質量測定 多糖樣品的純度鑒定和相對分子質量測定，參照Ma等［19］報道的高效液相凝膠滲透色譜法（HPGPC）稍作修改。色譜柱：PL aquagel-OH MIXED（7.5 mm×300 mm，8 μm），柱溫25℃，示差折光檢測器，流動相為NaAc-HAc/ water，流速1.0 mL/min，進樣量50 μL。

1.2.7.6 單糖組成分析 多糖樣品的單糖組成分析，參照Zhang等［17］報道的糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法稍作修改。色譜柱：OV-275色譜柱（0.32 mm×20 m）；升溫程序：120℃保持1 min，以20℃/min升至240℃，保持4 min；氣化室溫度260℃，檢測器溫度260℃，載氣（N2）流速3.0 mL/min，進樣量0.5 μL。

1.2.7.7 紅外光譜分析 多糖樣品的紅外光譜分析參照Chien等［20］報道的KBr壓片法，在傅立葉紅外光譜儀VECTOR22上進行。稱取2 mg左右經P2O5干燥的多糖樣品，與已干燥的適量KBr粉末在瑪瑙研缽中充分研磨均勻，用壓片機壓成薄片，進行紅外光譜測定，掃描范圍為4000～500 cm-1。測定樣品前用不加多糖樣品的KBr薄片進行背景基線掃描。

1.2.8 土黨參多糖神經營養(yǎng)活性研究 土黨參多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用按照Deng［21］和Zhang［22］等報道的方法略作修改。

1.2.9 數據統(tǒng)計分析 所有數據都以平均值（mean）±標準差（sd）表示，應用IBM公司SPSS 22.0軟件進行數據處理。采用單因素方差分析（ANOVA）進行差異顯著性分析，p＜0.05認為具有顯著差異。

2 結果與討論

2.1 土黨參粗多糖的提取

土黨參根經粉碎、回流除雜、熱水提取、乙醇沉淀、離心、凍干，可得到灰白色粉末狀固體，即土黨參粗多糖提取物。

2.2 土黨參多糖提取工藝條件的選擇

2.2.1 提取溫度對土黨參多糖得率的影響 不同提取溫度對土黨參多糖得率的影響，結果見圖1。

圖1 提取溫度對土黨參多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of CJP

由圖1可知，不同提取溫度對土黨參多糖得率有較大影響。在一定提取范圍內，土黨參多糖得率隨著提取溫度的升高而增大，提取溫度在70℃時土黨參多糖得率達到最大值，但此后，隨著溫度的上升，多糖得率變化趨勢不大，其原因可能與多糖本身的穩(wěn)定性有關，高溫浸提可能會導致土黨參多糖的降解，從而引起多糖得率的降低。綜合考慮，選擇70℃為最佳土黨參多糖提取溫度。

2.2.2 提取時間對土黨參多糖得率的影響 不同提取時間對土黨參多糖得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 浸提時間對土黨參多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of CJP

圖2表明，隨著提取時間的延長，土黨參多糖得率逐漸增大，這可能是隨著時間的延長，細胞破裂程度加大，從而使土黨參多糖更好的溶解到水中，多糖得率增大。但超過45 min之后，得率增加不明顯，而且時間延長還可能使多糖的結構發(fā)生變化，綜合成本方面考慮，最佳提取時間選擇在45 min。

2.2.3 液料比對土黨參多糖得率的影響 不同液料比對土黨參多糖得率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，液料比較小時，土黨參多糖得率有一些偏低，可能是因為溶劑量少使得物料變得粘稠，從而影響了多糖得率；液料比較高時得率較高，但液料比超過20∶1 mL/g后差異不顯著，同時由于溶劑量大使得后續(xù)處理不便。因此，綜合考慮，選擇液料比20∶1 mL/g為實驗中心點。

2.3 響應面實驗優(yōu)化

2.3.1 實驗設計與結果 響應面優(yōu)化具體實驗設計方案及結果見表2，設計了17個實驗點的響應面分析實驗，其中12個析因點，零點實驗進行了5次以估計誤差。

圖3 液料比對土黨參多糖得率的影響Fig.3 Effect of ratio of water to material on yield of CJP

表2 Box-Behnken設計模型及實驗值Table2 Box-Behnken design matrix and experimental values

2.3.2 土黨參多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析 利用Design-Expert軟件對表2中的實驗數據進行回歸分析，得到土黨參多糖得率對以上3個因素的回歸方程為：

土黨參多糖得率=28.15+1.30X1+3.59X2-3.58X3-1.62X1X2+4.31X1X3-1.53X2X3-4.29X12-5.55X22-4.03X32

對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可以看出：模型F值為114.72，p＜0.0001，表明模型是高度顯著的；模型的失擬項p=0.3158＞0.05，表明失擬不顯著，即該模型是穩(wěn)定的［9］，能較好地預測實際土黨參多糖提取情況。模型一次項X1、X2及X3均極顯著，且顯著順序是X2（提取時間）＞X3（液料比）＞X1（提取溫度）；二次項、交互項均顯著，表明各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

2.3.3 響應面分析及優(yōu)化 對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，提取溫度、提取時間、液料比3個因素之間交互作用對多糖得率的影響如圖4所示。結合方差分析結果可知，3個因素之間的交互作用對土黨參多糖得率的影響均顯著。

利用Design-Expert軟件，可得出土黨參多糖最佳提取工藝條件為提取溫度67.2℃、提取時間51.9 min和液料比16.6∶1 mL/g。考慮到具體操作的便利性，土黨參多糖最佳提取工藝條件最終確定為提取溫度67℃、提取時間52 min和液料比17∶1 mL/g。為了驗證模型方程的適用性，進行了5次驗證性實驗，此條件下土黨參多糖的平均得率為29.66%，而回歸方程所得的理論預測值為29.97%，經IBM SPSS Statistics 22軟件進行單樣本T檢驗表明p=0.47，即實驗值與預測值間不具有明顯差異。

表3 回歸模型方差分析Table3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

圖4 各因素交互作用對土黨參多糖得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plot showing the effect of factors on the yield of CJP

2.4 土黨參多糖的分離純化

2.4.1 土黨參多糖的DEAE-纖維素-52色譜法初步分離 將土黨參粗多糖CJP溶于適量蒸餾水中，加樣進行DEAE-52纖維素柱層析，依次用蒸餾水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCI溶液梯度洗脫，自動收集器分部收集，10 mL收集1管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測各管糖含量，繪制洗脫曲線，如圖5所示。

圖5 土黨參粗多糖的DEAE-52纖維素色譜柱洗脫曲線Fig.5 Elution profile of crude CJP on DEAE Cellulose-52 column

從圖5可以看出，DEAE-52纖維素柱層析用去離子水洗脫得土黨參中性多糖F-1組分，用0.1 mol/L NaCl洗脫得酸性多糖組分F-2。

2.4.2 初步純化組分經Sephadex G-100的進一步純化 對經DEAE-52纖維素色譜柱初步純化的組分F-1 和F-2，通過葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對其分別進行進一步純化，得到土黨參純化多糖CJPH和CJPN。

2.5 土黨參多糖的基本理化性質

土黨參多糖CJP及純化組分的CJPH和CJPN的總糖、蛋白質、糖醛酸及硫酸基含量如表4所示。

表4 土黨參多糖的基本理化性質Table4 Preliminary characterization of CJP

2.6 多糖CJPH和CJPN純度鑒定及相對分子質量測定

由圖6可以看出，土黨參多糖組分在色譜柱上均顯示為峰形對稱的單峰，說明純化多糖組分為均一多糖。利用在一定范圍內，多糖排阻體積與其相對分子質量的對數呈線性關系，通過標準曲線可知CJPH重均分子量Mw為3923 u，CJPN重均分子量Mw 為7215 u。

圖6 相對分子質量測定標準曲線、CJPH及CJPN的HPLC圖譜Fig.6 Standard curve of the molecular weight，HPLC spectrum of CJPH and CJPN

2.7 多糖CJPH和CJPN的單糖組成

6 種標準單糖及土黨參多糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖如圖7所示。

圖7 標準單糖、CJPH及CJPN的氣相色譜圖Fig.7 GC spectrum of monosaccharide references，CJPH and CJPN

對照保留時間及峰面積可知，CJPH含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖，它們的摩爾比為1∶3.1∶6.4；CJPN含有木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它們的摩爾比為1∶1.6∶3.7∶1.7∶6.4∶14.0。

2.8 多糖的紅外光譜分析

采用KBr壓片法，對土黨參多糖CJPH及CJPN進行了紅外光譜分析，其結果分別如圖8及圖9所示。

圖8 土黨參多糖CJPH的傅立葉變換紅外光譜圖Fig.8 FT-IR spectra of polysaccharides of CJPH

圖9 土黨參多糖CJPN的傅立葉變換紅外光譜圖Fig.9 FT-IR spectra of polysaccharides of CJPN

從圖8可以看出，在3386 cm-1位置處出現了寬而強的多糖羥基O-H伸縮振動峰，其值小于3400 cm-1，說明為分子間氫鍵，2929 cm-1附近出現多糖的C-H強伸縮振動峰，這兩個吸收峰均為多糖類物質的特征峰。圖9也表明，在3395 cm-1和2927 cm-1位置處均出現了多糖物質的特征吸收峰。

2.9 土黨參多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用

通過大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12培養(yǎng)體系，以NGF（50 ng/mL）為陽性對照，分別加入土黨參多糖（20 μg/mL）后連續(xù)培養(yǎng)14 d后在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)（200×），并進行顯微照相，實驗結果如圖10所示。

從圖10可以看出，土黨參多糖CJPH及CJPN部分長出神經樣纖維，說明CJPH及CJPN對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞具有一定的促分化作用，即CJPH及CJPN具有神經營養(yǎng)活性。

3 結論

圖10 土黨參多糖對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞分化的影響Fig.1 0 Effect of CJPH and CJPN on differentiation of rat adrenal pheochromocytoma PC12 cells

采用熱水浸提法對土黨參多糖的提取工藝進行了研究，考察了提取溫度、提取時間及液料比三因素及其交互作用對土黨參多糖得率的影響，根據Box-Benhnken中心組合實驗設計，利用Design-Expert軟件對數據進行回歸分析，結合等高線及響應曲面圖，確定了土黨參多糖最佳提取工藝條件為提取溫度67℃、提取時間52 min和液料比17∶1 mL/g。在此工藝下，提取得到的土黨參多糖CJP經DEAE-52纖維素柱層析分離，葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析純化，得到兩種土黨參多糖CJPH和CJPN，并采用化學、氣相色譜、高效液相色譜及紅外光譜等方法對其理化性質、單糖組成等進行了分析研究。通過土黨參多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用研究表明，CJPH 及CJPN對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞具有一定的促分化作用，表明其具有神經營養(yǎng)活性。目前有關多糖神經營養(yǎng)活性方面的報道并不多見，通過多糖對PC12細胞的分化作用的研究，對于揭示神經營養(yǎng)因子類物質的作用機理以及開發(fā)利用土黨參資源具有重要意義。

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Optimization of extraction conditions of polysaccharides from Campanumoea javanica Blume by response surface methodology and evaluation of its neurotrophic activities

ZHANG Zhan-jun1，2，YANG Xiao-sheng1，*
（1.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China；2.College of Biological and Chemical Engineering，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，China）

Extraction optimization，purification and physicochemicalproperties ofpolysaccharides from Campanumoea javanica Blume（CJP）were investigated.The neurotrophic activity of polysaccharides from C.javanica Blume were investigated by PC12 cell assay.Single factor experiment and response surface methodology（RSM）were used to optimize the extraction conditions of CJP.As a result，the optimal conditions were as follows：extraction temperature，67℃，extraction time，52 min，and ratio of water to raw material，17∶1 mL/g.The crude CJP were purified by DEAE-Cellulose 52 chromatography and Sephadex G-100 chromatography to afford CJPH and CJPN.The content of total sugar，protein，uronic acid and sulfate were analyzed by chemical analysis methods.HPLC analysis showed that CJPH and CJPN were homogeneous polysaccharide，the molecular weights of CJPH and CJPN were 3923 u and 7215 u，respectively.Monosaccharide composition analysis was acted by using the GC method.Infrared spectroscopy analysis indicated that CJPH and CJPN showed typical peaks of polysaccharide.The assay of PC12 cell showed that CJPH and CJPN had neurotrophic activity.Studies had shown that CJPH and CJPN could obviously repairing nerve cell damage，they had certain development value.

polysaccharides；response surface methodology；optimization；extraction；purification；characterization； bioactivity

TS201.2

B

1002-0306（2016）06-0291-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.051

2015－10－08

張占軍（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：moutailafite@163.com。

楊小生（1966-），男，博士，研究員，研究方向：活性天然產物研究與開發(fā)，E-mail：gzcnp@sina.cn。

貴州省科技廳人才項【黔科合人才團（2013）4006；黔科合人才［2015］4027號】；江蘇省高等職業(yè)院校國內高級訪問學者計劃資助項目（2015FX092）。