馬海華，孫楫舟，甄 彤，張 元，4，*，夏善紅（.傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院電子學(xué)研究所，北京0090；2.中國科學(xué)院大學(xué)研究生院，北京00080；.河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州45000；4.糧食信息處理與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州45000）

我國國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中黃曲霉毒素測定方法綜述

馬海華1，2，3，4，孫楫舟1，甄 彤3，張 元1，4，*，夏善紅1
（1.傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院電子學(xué)研究所，北京100190；2.中國科學(xué)院大學(xué)研究生院，北京100080；3.河南工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州450001；4.糧食信息處理與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450001）

黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，能夠污染多種農(nóng)作物和食品，對(duì)人類的健康造成極其嚴(yán)重的危害。目前，尚無絕對(duì)有效的措施避免黃曲霉毒素的污染，因此，制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)一步規(guī)范和加強(qiáng)對(duì)黃曲霉毒素的檢測和監(jiān)控顯得尤為重要。截至到2015年1月，我國現(xiàn)行的針對(duì)黃曲霉毒素的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)共有21個(gè)，其中有11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)在2010～2015年發(fā)布實(shí)施。本文全面綜述了21個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中采納的7種測定方法及其特點(diǎn)，其中高效液相色譜法是目前廣泛使用的最權(quán)威的確證定量測定方法，而免疫層析法則是最簡便的快速篩查定性檢測方法。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步討論了標(biāo)準(zhǔn)的制修訂現(xiàn)狀，并展望了黃曲霉毒素檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。

黃曲霉毒素，標(biāo)準(zhǔn)，測定，方法

黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，主要是黃曲霉和寄生曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］。在已經(jīng)能夠分離并識(shí)別的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）和G2（AFG2）是最主要的四種［2］。另外，當(dāng)奶牛攝入受AFB1污染的飼料后，AFB1在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成黃曲霉毒素M1（AFM1），存在于奶牛的乳汁中［3］。在激發(fā)光波長為365 nm的紫外光照射下，AFB1和AFB2發(fā)射450 nm藍(lán)色熒光，AFG1和AFG2發(fā)射425 nm綠色熒光。

黃曲霉毒素是一種劇毒物質(zhì)，具有嚴(yán)重的致癌性、致畸性和致突變性［4］，其中，AFB1的毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素能夠污染谷物、玉米、大米、花生、堅(jiān)果、牛奶等多種農(nóng)作物和食品。人或動(dòng)物攝入了受黃曲霉毒素污染的食物或飼料，會(huì)造成急性中毒死亡或慢性積累致癌等極其嚴(yán)重的危害。

黃曲霉毒素對(duì)人類健康和生命的嚴(yán)重危害引起了世界的廣泛關(guān)注，許多國家及標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)和組織紛紛制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范和加強(qiáng)對(duì)黃曲霉毒素的檢測和監(jiān)控。近十年，我國在針對(duì)黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂方面發(fā)展迅速，目前，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)共21個(gè)（不含1個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)），其中國家標(biāo)準(zhǔn)10個(gè)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)11個(gè)。關(guān)于國內(nèi)外真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)的制修訂現(xiàn)狀的綜述［5-6］已有發(fā)表，但是尚無針對(duì)我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中黃曲霉毒素檢測方法的詳細(xì)論述，而且由于新的標(biāo)準(zhǔn)不斷發(fā)布實(shí)施，已有綜述中所涵蓋的標(biāo)準(zhǔn)已無法全面闡述當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀，例如，杜英秋等［6］給出我國針對(duì)黃曲霉毒素檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)有16個(gè)（含1個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)，不含1個(gè)限量標(biāo)準(zhǔn)），而2014年新增5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，目前共計(jì)21個(gè)。

1 黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)

我國衛(wèi)生部2011年發(fā)布實(shí)施的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2011［7］規(guī)定了谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品以及特殊膳食用食品中AFB1的最高限量，以及乳及乳制品和嬰幼兒配方食品中AFM1的最高限量，但是并未對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總量做出限量要求。具體限量指標(biāo)見表1［7］和表2［7］所示。

表1 食品中黃曲霉毒素B1限量指標(biāo)Table1 Maximum levels of AFB1in foodstuffs

2 黃曲霉毒素測定方法

在制定食品中黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，進(jìn)一步完善黃曲霉毒素測定方法的標(biāo)準(zhǔn)也是至關(guān)重要的。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，我國不斷對(duì)已有標(biāo)準(zhǔn)做出修訂并制定相應(yīng)的新標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中采納的黃曲霉毒素測定方法主要有7種，分別是薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS）、熒光光度法（fluorometry）、微柱篩選法（microcolumn screening）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫層析法（immunochromatography）。這些方法的適用范圍及檢測指標(biāo)見表3。

2.1 薄層色譜法

TLC是早期應(yīng)用最廣泛的真菌毒素分析技術(shù)，被列為國際分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）標(biāo)準(zhǔn)方法［28］。目前，我國共有4個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)采納TLC，分別是：GB/T 5009.22-2003［9］、GB/T 5009.23-2006［12］、GB 8381-2008［15］和GB 5009.24-2010［19］。

TLC基于黃曲霉毒素在紫外光下能夠產(chǎn)生熒光的物理特性，具有制備分離、定性和半定量的分析功能。首先，試樣中的黃曲霉毒素經(jīng)三氯甲烷等提取、過濾，用溶劑分配凈化［9，12，19］或硅膠柱純化［15］、濃縮，滴加在硅膠G制備的薄層板上，采用單向展開或雙向展開法，用展開劑將試液層析展開、分離，在紫外燈下用目測法或薄層掃描儀熒光法檢測熒光強(qiáng)度。如果與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的位置上無熒光點(diǎn)，則表示試樣中黃曲霉毒素的含量在檢出限（例如AFB1為5 μg/kg［9，12］）以下；如果有熒光點(diǎn)，則需要進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)；如果樣液中熒光強(qiáng)度比檢出限所顯示的強(qiáng)，則需進(jìn)行稀釋定量，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與檢出限點(diǎn)的熒光強(qiáng)度一致為止。

TLC設(shè)備簡單，易于普及，在早期使用較為廣泛。但是，傳統(tǒng)TLC的樣品前處理繁瑣，實(shí)驗(yàn)過程較復(fù)雜，耗時(shí)長，且受樣品提取、純化、展開、分離等多種因素的影響［29］，精確性較差，逐漸被HPLC所取代［30］。

表3 標(biāo)準(zhǔn)中采納的黃曲霉毒素測定方法的比較Table3 Comparison of aflatoxins determination methods applied in standards

續(xù)表

2.2 高效液相色譜法

HPLC是當(dāng)前國內(nèi)外檢測黃曲霉毒素最權(quán)威的方法，也是AOAC的官方方法之一。其中，與熒光檢測器聯(lián)用的高效液相色譜法（HPLC-FLD）是目前使用最為廣泛的一種方法［31］。我國共有5個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)和4個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采納HPLC，分別是：國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18979-2003［8］、GB/T 5009.23-2006［12］、GB/T 23212-2008［17］、GB/T 5413.37-2010［18］和GB/T 30955-2014［27］，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1664-2005［10］、SN/T 1736-2006［11］、NY/T 1286-2007［13］和SN/T 3263-2012［22］。

HPLC是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，將溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。HPLC用于黃曲霉毒素檢測時(shí)，首先，提取溶劑（甲醇、乙腈、三氯甲烷等）提取試樣中的黃曲霉毒素，提取后的溶液經(jīng)過濾、凈化后，注入反相C18色譜柱，用帶熒光檢測器的高效液相色譜儀測定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積），外標(biāo)法定量［12-13］。

為進(jìn)一步提高樣品的凈化、提純程度，減小雜質(zhì)干擾，7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)［8，10-11，17-18，22，27］將HPLC與免疫親和層析技術(shù)相結(jié)合，從而提高檢測的特異性和靈敏度。免疫親和柱將黃曲霉毒素特異性抗體交聯(lián)在柱內(nèi)固體支持物上，當(dāng)提取液通過免疫親和柱時(shí)，黃曲霉毒素與抗體結(jié)合。用水清洗免疫親和柱，去除柱內(nèi)的雜質(zhì)，然后用洗脫劑（甲醇等）洗脫吸附在柱上的黃曲霉毒素。

為進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，特別是提高AFB1和AFG1的熒光強(qiáng)度，發(fā)展了一系列柱前衍生或柱后衍生技術(shù)，例如柱前三氟乙酸衍生［10，12-13］、柱后碘衍生［8，11］、柱后溴衍生［17，22］、柱后光化學(xué)衍生［22，27］和柱后電化學(xué)衍生［22］，其中柱前三氟乙酸衍生方法已經(jīng)被采納為AOAC標(biāo)準(zhǔn)方法。柱前三氟乙酸衍生方法利用AFB1和AFG1的雙呋喃環(huán)的雙鍵結(jié)構(gòu)在酸性溶液中容易水解，轉(zhuǎn)化為富含羥基的熒光強(qiáng)度更高的衍生物AFB2a和AFG，從而提高熒光檢測的靈敏度。

HPLC-FLD具有準(zhǔn)確性、靈敏度和分辨率高的優(yōu)點(diǎn)［29］，能夠同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素，實(shí)現(xiàn)定性、定量分析。但是，該方法操作步驟復(fù)雜繁瑣，在分離黃曲霉毒素類似物時(shí)耗時(shí)長，由于AFB1和AFG1的熒光檢測靈敏度較低，需要增加衍生處理［33］。另外，該方法需要專業(yè)技術(shù)人員操作，所需儀器設(shè)備昂貴，主要應(yīng)用在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。

2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

LC-MS結(jié)合了色譜對(duì)復(fù)雜樣品分離能力強(qiáng)以及質(zhì)譜的選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，是目前黃曲霉毒素確證性檢測技術(shù)發(fā)展的方向［31］。我國在2010年發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5413.37-2010［18］以及在2011、2012年分別發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2071-2011［20］和SN/T 3136-2012［21］中將LC-MS作為黃曲霉毒素的一種測定方法。

LC-MS的液相色譜系統(tǒng)用于分離，質(zhì)譜系統(tǒng)用于檢測。首先，試樣中的黃曲霉毒素經(jīng)提取液提取后稀釋、過濾，再經(jīng)免疫親和柱［18，21］或霉菌毒素多功能凈化柱［20］凈化，然后經(jīng)液相色譜分離，電噴霧離子源離子化，采用多反應(yīng)離子監(jiān)測方式檢測，根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片及其離子豐度比定性，外標(biāo)法定量。

實(shí)際上，農(nóng)作物等實(shí)際樣品通常受到多種霉菌毒素的污染，因此，多種霉菌毒素的同步測定具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。LC-MS在具備高效分離的同時(shí)可實(shí)現(xiàn)多組分定性與定量檢測，能夠提供相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)信息，具有高靈敏度和高選擇性，適合于微量樣品中的痕量組分分析，且無需柱前衍生和柱后衍生步驟，逐漸成為同步精確測定黃曲霉毒素及多種霉菌毒素的一種重要方法［33-34］。已有文獻(xiàn)報(bào)道使用HPLC-MS同時(shí)檢測AFB1和OTA等多種霉菌毒素［31，35］。但是，該方法對(duì)儀器設(shè)備、環(huán)境條件及操作人員的專業(yè)水平要求高，主要應(yīng)用在部分專業(yè)實(shí)驗(yàn)室［29，34］。

2.4 熒光光度法

熒光光度法是利用了物質(zhì)的分子/原子輻射躍遷的原理，其發(fā)出熒光的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)定性、定量檢測。我國共有2個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)和2個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采納熒光光度法，分別是：國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18979-2003［8］和GB/T 5413.37-2010［18］，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3263-2012［22］和NY/T 2549-2014［23］。

熒光光度法通常采用無分離直接檢測模式，為了減小干擾，提高靈敏度，標(biāo)準(zhǔn)均采用熒光光度計(jì)與免疫親和層析凈化技術(shù)相結(jié)合的方式。樣品經(jīng)提取、脫脂［18］過濾后，經(jīng)過免疫親和柱進(jìn)行層析凈化，洗脫液中加入溴溶液衍生［8，18，22］或加入氯化汞熒光增強(qiáng)劑［23］，以提高測定靈敏度，用熒光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度值，計(jì)算得到黃曲霉毒素含量。

免疫層析凈化熒光光度法具有選擇性強(qiáng)、定量精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，比TLC的靈敏度有所提高。因?yàn)椴捎脽o分離方式，所以與HPLC和LC-MS相比，操作較為簡化、儀器設(shè)備簡單，但同時(shí)正是由于該方法沒有分離功能［29］，只有檢測功能，所以只適用于黃曲霉毒素總量的測定。鑒于以上這些特點(diǎn)，熒光光度法通常作為一種篩選方法，對(duì)于陽性樣品采用HPLC或LC-MS進(jìn)一步分離和解析。

2.5 微柱篩選法

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.23-2006［12］采納微柱篩選法作為一種快速定性篩查方法。樣品提取液通過由硅鎂吸附劑和氧化鋁組成的微柱層析管后，黃曲霉毒素被硅鎂吸附劑吸附，雜質(zhì)被氧化鋁吸附。在紫外燈下觀察結(jié)果，將層析后的樣品管依次與0、5和10 ng的AFB1標(biāo)準(zhǔn)管比較。如果樣品管內(nèi)硅鎂吸附劑層與0 ng標(biāo)準(zhǔn)管一致，則為陰性（5 μg/kg以下），如果呈現(xiàn)藍(lán)紫色熒光，則為陽性。

微柱篩選法設(shè)備簡單、操作簡便，但是，微柱不能分離AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，所以，該方法只能檢測黃曲霉毒素的總量，是一種適用于樣品快速篩查的定性檢測方法。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的基于免疫學(xué)和酶促反應(yīng)的檢測技術(shù)，利用抗原-抗體反應(yīng)的高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感性實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的檢測，已成為AOAC官方方法之一。我國采納ELISA的有3個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)和1個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，分別是：GB/T 5009.22-2003［9］、GB/T 17480-2008［16］、GB/T 5413.37-2010［18］和NY/T 1664-2008［14］。

ELISA有直接競爭和間接競爭兩種模式。GB/T 17480-2008［16］采用直接競爭模式，用AFB1特異性抗體包被酶標(biāo)微孔板，樣品中的AFB1經(jīng)過提取和稀釋處理后，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的AFB1競爭結(jié)合酶標(biāo)板中的AFB1抗體，牛血清蛋白（BSA）封閉剩余的活性位點(diǎn)，加入酶底物后顯色，樣品中AFB1的含量與顏色成反比。對(duì)于結(jié)果的判定，可采用目測法比較樣品液孔與標(biāo)準(zhǔn)溶液孔的顏色，也可使用酶標(biāo)儀測定吸光度值。GB/T 5009.22-2003［9］采用間接競爭模式，不同之處在于，使用AFB1-BSA人工抗原包被酶標(biāo)微孔板，樣品中的AFB1與定量的AFB1單克隆抗體混合，發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合，然后加入到酶標(biāo)微孔板，多余的游離抗體與酶標(biāo)板內(nèi)的AFB1-BSA結(jié)合。

黃曲霉毒素ELISA試劑盒的出現(xiàn)，在一定程度上縮短了檢測時(shí)間。GB/T 5413.37-2010［18］和NY/T 1664-2008［14］即采用AFM1雙流向酶聯(lián)免疫試劑盒，目測或使用酶聯(lián)免疫檢測讀數(shù)儀判讀結(jié)果，實(shí)現(xiàn)定性檢測。

ELISA利用抗原-抗體的親和性反應(yīng)，特異性強(qiáng)，樣品的前處理過程較簡單，回收率較高，操作較為簡便，可以進(jìn)行定性或定量測定［3，29］。但是，作為標(biāo)記物的酶，其活性易受反應(yīng)條件的影響，例如pH的高低或金屬離子的存在會(huì)破壞酶的活性，容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

2.7 免疫層析法

免疫層析是一種快速篩查的定性或半定量檢測技術(shù)，近年來在黃曲霉毒素檢測應(yīng)用中得到了廣泛關(guān)注。它利用毛細(xì)管作用，液體流經(jīng)多孔薄膜時(shí)將未結(jié)合的反應(yīng)物與結(jié)合的反應(yīng)物在液體－固體界面分離開［36］，利用標(biāo)記物質(zhì)在試紙質(zhì)控線和/或檢測線區(qū)域的顯色確定樣品的陰性或陽性結(jié)果。我國共有3個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采納免疫層析法，分別是：LS/T 6108-2014［26］、NY/T 2550-2014［24］和NY/T 2548-2014［25］。

LST 6108-2014［26］規(guī)定了兩種免疫層析法：酶標(biāo)記免疫層析法和膠體金免疫層析法。酶標(biāo)記免疫層析法使用商用AFB1酶聯(lián)免疫檢測卡，試樣經(jīng)甲醇溶液提取、過濾或離心、稀釋后，加入檢測卡中。試樣中AFB1與固相載體上的抗體結(jié)合后再與固定在檢測線的酶標(biāo)二抗結(jié)合，使檢測線顯色。通過檢測線是否顯色及顯色時(shí)間長短來判定試樣中AFB1的含量。

LS/T 6108-2014［26］和NY/T 2550-2014［24］都采納了膠體金免疫層析法。試樣經(jīng)提取、過濾或凈化柱凈化［24］、稀釋后，加入商用檢測卡中。試樣中的AFB1先與固定在檢測卡金標(biāo)區(qū)的膠體金標(biāo)記AFB1抗體結(jié)合，受毛細(xì)管作用向檢測線和質(zhì)控線擴(kuò)散?？捎媚繙y法［24，26］、光譜成像檢測儀或膠體金免疫層析檢測儀［24］判定結(jié)果。若質(zhì)控線和檢測線均顯色，則為陰性結(jié)果；若質(zhì)控線顯色，檢測線不顯色，則為陽性結(jié)果；若質(zhì)控線和檢測線均不顯色，則為無效結(jié)果。

NY/T 2548-2014［25］采用時(shí)間分辨熒光免疫層析法。該方法以三價(jià)稀土離子銪作為熒光標(biāo)記物，試樣經(jīng)提取、過濾、凈化柱凈化后與銪標(biāo)記的AFB1抗體混合，抗原-抗體的結(jié)合抑制了層析過程中抗體與固定在檢測線上的AFB1-BSA的免疫反應(yīng)，使檢測線時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度降低，用時(shí)間分辨熒光檢測儀通過檢測時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行定量測定。

在免疫層析法中，標(biāo)記物是影響檢測性能的一個(gè)重要因素。文獻(xiàn)報(bào)道了使用磁珠［37-38］作為抗體標(biāo)記物富集和分離牛奶樣品中的AFM1或使用平均直徑為75 nm左右的金納米花［39］標(biāo)記抗體作為信號(hào)放大探針，可進(jìn)一步降低檢測下限，提高靈敏度。

免疫層析法操作簡單、成本低，檢測過程中一般不需要使用其他試劑，能夠?qū)崿F(xiàn)一步現(xiàn)場快速檢測［40］，例如，檢測時(shí)間為5 min［26］或10 min［24］。隨著商用檢測卡的推出，該方法作為一種快速定性篩查方法得到了更廣泛的應(yīng)用。但是，免疫層析法的靈敏度不高、裸眼讀取結(jié)果誤差大、實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測較困難。

3 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)制修訂現(xiàn)狀分析與展望

在標(biāo)準(zhǔn)的制修訂時(shí)間和數(shù)量方面，我國現(xiàn)行的針對(duì)黃曲霉毒素的21個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（不含1個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)）中的11個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在2010～2014年間制修訂的，可見近幾年標(biāo)準(zhǔn)的制修訂工作發(fā)展迅速。黃曲霉毒素測定方法標(biāo)準(zhǔn)一般采納一種或多種檢測方法，其中共計(jì)9個(gè)標(biāo)準(zhǔn)采納HPLC熒光檢測法，4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分別采納TLC、熒光光度法和ELISA，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分別采納LC-MS和免疫層析法，僅1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)采納微柱篩選法。HPLC涉及的檢測樣品種類最多，包括谷物、花生、干果、乳、乳粉、植物油脂、醬油、食醋、蜂蜜和茶葉等，說明該方法適用范圍廣，是一種權(quán)威的能夠同時(shí)檢測多種黃曲霉毒素的確證定量分析方法。LC-MS自2010年被引入標(biāo)準(zhǔn)中，而同時(shí)期，AOAC、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）、歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CEN）制定的標(biāo)準(zhǔn)中尚未引入該法。LC-MS因其能夠同時(shí)精確定量并識(shí)別多種霉菌毒素，必將在今后得到更廣泛的應(yīng)用。另外，2014年制定的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，有3個(gè)是針對(duì)免疫層析法，該方法是實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素快速篩查定性檢測的一個(gè)重要發(fā)展方向。

在關(guān)鍵技術(shù)方面，TLC、HPLC、熒光光度法和微柱篩選法都是利用了黃曲霉毒素在紫外光下能夠發(fā)出熒光的物理特性，通過熒光的強(qiáng)弱判讀和計(jì)算結(jié)果。而ELISA和免疫層析法則是基于免疫親和反應(yīng)原理并結(jié)合酶或膠體金的顯色反應(yīng)。另外，LC-MS利用了色譜的分離技術(shù)和質(zhì)譜的檢測技術(shù)，根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片及其離子豐度比定性和定量。同時(shí)，在樣品前處理中，HPLC、LC-MS和熒光光度法都引入免疫親和柱用于凈化提純。因此，目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用的檢測方法主要是基于色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、熒光檢測技術(shù)和免疫親和技術(shù)?；诖笮蛢x器的色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)作為多靶標(biāo)物質(zhì)同時(shí)檢測的主要技術(shù)，是黃曲霉毒素確證定量檢測的一個(gè)重要發(fā)展方向。基于三價(jià)稀土離子的上轉(zhuǎn)換熒光技術(shù)，因作為熒光標(biāo)記物的三價(jià)稀土離子具有較長的亞穩(wěn)能級(jí)壽命，是提高檢測穩(wěn)定性的一個(gè)重要研究方向?；诳乖贵w結(jié)合的免疫親和技術(shù)，其選擇性主要依賴于抗體的選擇性，由于不同種黃曲霉毒素間分子結(jié)構(gòu)的差別非常小，所以如何制備高選擇性的抗體是免疫親和技術(shù)的一個(gè)重要研究方向。

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［23］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 2549-2014飼料中黃曲霉毒素B1的測定免疫親和熒光光度法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

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A review on aflatoxins determination methods in China's national and industry standards

MA Hai-hua1，2，3，4，SUN Ji-zhou1，ZHEN Tong3，ZHANG Yuan1，4，*，XIA Shan-hong1
（1.State Key Laboratory of Transducer Technology，Institute of Electronics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080，China；3.College of Information Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；4.Key Laboratory of Grain Information Processing and Control of Ministry of Education，Zhengzhou 450001，China）

Aflatoxins were widely found in nature，wich could contaminate many kinds of agriculture products and food，causing serious harm to the health of humans.Now，absolutely effective strategies do not have been developed for avoiding aflatoxins contamination.Therefore，establishing regulations and standards designed to standardize aflatoxins detection and strengthen supervision were considered to be very important.Till Jan.2015，there were totally twenty-one national and industry standards for aflatoxins existing in our country，consisting eleven standards that were issued and entered into force between 2010 and 2015.This review dealt with seven determination methods applied in standards.High performance liquid chromatography was now widely used as an authoritative quantitative confirmatory method，and High Performance Liquid Chromatography was a simple qualitative method for fast screening detection.Based on these，the current status in development and revision of the standards were further discussed.Meanwhile，the trends of technologies for aflatoxins determination were proposed.

aflatoxins；standards；determination；methods

TS207.2

A

1002-0306（2016）06-0360-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.064

2015－06－12

馬海華（1979-），女，博士研究生，講師，研究方向：生化微傳感器與霉菌毒素檢測，E-mail：mahaihua@huat.edu.cn。

張?jiān)?961-），男，教授，研究方向：儲(chǔ)糧生物危害物檢測及智能信號(hào)處理與微系統(tǒng)技術(shù)，E-mail：zhangyuan@haut.edu.cn。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA101608）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（61401433，61201389）。