由 慶，徐 偉（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

枯草芽孢桿菌QM11漆酶基因克隆表達及序列分析

由 慶，徐 偉*
（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

為獲得高效表達的產(chǎn)漆酶工程菌，將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的漆酶（cotA）基因在大腸桿菌中表達。用PCR的方法從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QM11基因組中擴增cotA基因，連接載體pET22b構(gòu)建成表達載體pET22b-cotA，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）進行誘導(dǎo)表達，最終通過SDS-PAGE檢測蛋白表達情況?？寺〉玫降腸otA基因含有1542個核苷酸，由513個氨基酸組成，預(yù)測相對分子量為58 ku，理論等電點為5.91，無信號肽，二級結(jié)構(gòu)以β-折疊和無規(guī)卷曲為主，其中β-折疊占26.71%，無規(guī)卷曲占52.05%，與NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因（GenBank：GQ184294.1）堿基序列有12個堿基的差異，其編碼的氨基酸序列有4個發(fā)生了改變。通過SDS-PAGE檢測，目標(biāo)蛋白相對分子質(zhì)量約為54 ku，與預(yù)測相對分子量基本相符。

枯草芽孢桿菌，漆酶，基因克隆，序列分析，表達載體構(gòu)建，誘導(dǎo)表達

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類化合物氧化，同時將分子氧還原為水［1］，廣泛應(yīng)用于造紙及食品工業(yè)等。秸稈是我國主要的農(nóng)業(yè)廢棄物［2］，主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，秸稈降解的關(guān)鍵就是處理包裹在纖維素和半纖維素外面的木質(zhì)素［3］。木質(zhì)素是由帶有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的單體交聯(lián)組成的三維高聚物，漆酶可以有效的降解木質(zhì)素。

在自然界中能夠降解木質(zhì)素并產(chǎn)生相應(yīng)酶類的生物只占少數(shù)，主要是真菌和細菌［4-6］。由于與真菌漆酶結(jié)構(gòu)不同，細菌漆酶無需糖基化、熱穩(wěn)定性高、可耐受更高的pH及Cu2+抗性［7］等特點比真菌漆酶更有優(yōu)勢。Suzuki等［8］發(fā)現(xiàn)一種來源于細菌的漆酶可在70℃條件下保溫20 min依然保持較高的酶活。Ruijssenaars等［9］也發(fā)現(xiàn)了一種最適pH在7.5～8的細菌漆酶。

本研究以從森林土壤中分離得到的高產(chǎn)漆酶細菌枯草芽孢桿菌QM11為研究對象，通過設(shè)計特異性引物擴增出cotA基因，進行序列分析，通過構(gòu)建pET22bcotA重組表達載體，將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）菌株中，以期實現(xiàn)重組漆酶cotA的高效表達，提高漆酶cotA的比活力，進一步增加細菌漆酶的產(chǎn)量，提高秸稈的降解效率，為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物資源化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司；表達載體pET22b 購自于美國Novagen公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QM11 本實驗室保藏；限制性內(nèi)切酶 購自美國NEB公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒 購自上海生工生物工程股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 購自北京天根生化科技有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

PCR儀 美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國SIM公司；電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 QM11基因組DNA的提取 QM11基因組DNA提取按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書操作。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，121 V電壓，20 min，檢驗完整性并采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總DNA保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI中已公布的枯草芽孢桿菌cotA基因序列（GenBank登錄號GQ184294），用Primer 5.0軟件設(shè)計引物QM-F 5'-CGGGATCCATGA CACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3'；QM-R 5'-ATA AGAATGCGGCCGCTTTATGGGGATCAGTTATATCC ATCG-3'，并在其上下游分別引入酶切位點BamHⅠ和NotⅠ（下劃線部分所示），上下游引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 QM11 cotA基因擴增 PCR反應(yīng)采用50 μL體系，模版DNA 1 μL、10 μmol/L QM-F及QM-R各1 μL、10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl23μL、dNTP mixture 3 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL、ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠純化目的條帶，PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，藍白斑篩選出陽性克隆，挑取陽性克隆進行測序，基因序列由上海生工生物工程公司進行測定。

1.2.4 QM11 cotA基因的生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果采用Vector NTI 10.0進行序列比對分析。相對分子量與理論等電點預(yù)測采用ExPASy在線服務(wù)器的Compute PI/Mw工具（http：//web.expasy.org/compute_pi/）。采用在線軟件SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽序列的預(yù)測。采用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page= npsa_sopm.html預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，采用SWISSS MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三維建模。

1.2.5 重組表達載體的構(gòu)建及重組子的篩選 將pMD18-cotA重組質(zhì)粒與表達質(zhì)粒pET22b分別用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，121 V，20 min，回收目的片段，將目的基因的酶切片段與酶切處理后的表達質(zhì)粒pET22b進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），在含有氨芐青霉素（50 μg/mL）的LB抗性平板上37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基中，37℃150 r/min搖菌過夜，并進行菌落PCR驗證。

1.2.6 重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 挑取正確的轉(zhuǎn)化子過夜活化后，以1%的接種量轉(zhuǎn)接至氨芐青霉素（50 mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至OD600達到0.6時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L開始誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)的1、2、3、4 h取樣，同時未誘導(dǎo)的作為對照。

1.2.7 重組蛋白的SDS-PAGE 收集誘導(dǎo)表達后的菌液，12000 r/min離心10 min，沉淀加入5 mL PBS溶液，進行超聲破碎。破碎后的溶液12000 r/min離心10 min，取上清進行SDS-PAGE電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。

2 結(jié)果與分析

2.1 QM11總DNA提取及目的基因的擴增

圖1 QM11基因組DNA提取結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of total DNA extracted from QM11 cotA

圖2 基因組DNA擴增結(jié)果Fig.2 Electrophoretic profile of PCR products of cotA

如圖1所示，QM11基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可知，條帶單一，清晰可見，說明DNA完整性較好。以提取的基因組DNA為模版，利用QM-F及QM-R進行PCR擴增，得到1500 bp左右的一條帶，如圖2所示，大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 cotA基因序列的測定及分析

將擴增獲得的cotA基因進行TA克隆，獲得重組的pMD18-T-cotA，轉(zhuǎn)化JM109后，藍白斑篩選后，將重組子送于上海生工生物工程有限公司進行測序。

將測得的序列進行生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，cotA基因含1542個核苷酸，其中GC含量為48.02%，編碼513個氨基酸組成（圖3），相對分子量為58436.07，理論等電點為5.91。在線軟件SignalP 4.1 Server分析結(jié)果表明cotA基因無信號肽。將推導(dǎo)的氨基酸序列提交http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行同源比對，結(jié)果顯示該序列與Bacillus sp.WN01和Bacillus sp.LS02等cotA基因同源性較高，均達到99%。漆酶cotA堿基序列與已公布的Bacillus subtilis漆酶基因（NCBI GenBank：GQ184294.1）堿基序列有12個堿基的差異，其編碼的氨基酸序列有4個發(fā)生了改變。

圖3 cotA基因序列及對應(yīng)的氨基酸序列Fig.3 DNA sequence of cotA gene and deduced amino acid sequence of cotA protein

2.3 cotA蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

采用SOPM二級結(jié)構(gòu)預(yù)測程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl）進行cotA蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。由圖4可知，α-螺旋占14.04%（72個），β-折疊為26.71%（137個），β-轉(zhuǎn)角為7.21%（37個），無規(guī)則卷曲為52.05%（267個）。

2.4 cotA三維結(jié)構(gòu)建模

圖4 cotA蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Deduced secondary structure of cotA protein

圖5 cotA蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Deduced 3-D structure of cotA protein

進入Swiss-Model三維結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器，提交cotA基因編碼的氨基酸序列，所得結(jié)果見圖5。cotA蛋白三級結(jié)構(gòu)模型的建立是以4akq.1.A為模板，一致性達到99.22%，QMEAN4值為0.45。觀察cotA蛋白三級結(jié)構(gòu)，圖5中的4個黑色球為蛋白中含有的4個銅原子，具有由3個杯狀結(jié)構(gòu)域緊密組成的漆酶的球狀構(gòu)象。

2.5 原核表達載體的構(gòu)建及重組子的篩選

將pMD18T-cotA和載體pET22b分別用BamHⅠ、NotⅠ進行雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，用T4 DNA連接酶進行連接，將pET22b-cotA表達載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)的E.coli BL21宿主菌，涂布于含氨芐青霉素的LB平板，挑取8個陽性克隆，進行菌落PCR鑒定，經(jīng)菌落PCR均擴增出一段1500 bp左右的片段（圖6），證明為正確的轉(zhuǎn)化子。

圖6 重組子鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of constructed plasmid

2.6 cotA融合蛋白的原核表達

分別將未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)過夜的E.coli BL21的總蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳，重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，與對照比較，1、2、3、4 h后在54 ku處均有明顯條帶（圖7）。該條帶所示的蛋白分子量與理論值相符，表明成功表達了cotA蛋白。

圖7 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE profile of expressed products

3 結(jié)論

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類物質(zhì)的氧化，過去認(rèn)為漆酶主要存在于植物以及真菌中，且研究主要集中在真菌漆酶上，而關(guān)于細菌漆酶的研究在近幾年才逐漸開展。

本研究從Bacillus subtilis QM11中克隆得到了漆酶基因cotA，以基因組為模板，PCR擴增出的核酸序列全長為1542個核苷酸，編碼513個氨基酸組成，預(yù)測相對分子量為58436.07，理論等電點為5.91，無信號肽，cotA蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：其中α-螺旋占14.04% （72個），β-折疊為26.71%（137個），β-轉(zhuǎn)角為7.21% （37個），無規(guī)卷曲為52.05%（267個）。經(jīng)過BLAST比對，該序列與Bacillus sp.WN01和Bacillus sp.LS02等cotA基因同源性較高，均達到99%。漆酶cotA堿基序列與已公布的Bacillus subtilis漆酶基因（NCBI GenBank：GQ184294.1）堿基序列有12個堿基的差異，其編碼的氨基酸序列有4個發(fā)生了改變。將Bacillus subtilis的漆酶基因克隆到表達載體pET22b，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），通過含有Amp的LB平板篩選單克隆，使用IPTG進行誘導(dǎo)表達，最終通過SDS-PAGE進行檢測，表達產(chǎn)物分子量約為54 ku，與預(yù)測分子量基本一致。為獲得高效表達的產(chǎn)漆酶工程菌以及提高漆酶產(chǎn)量及酶活力奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning，expression and characterization of laccase from Bacillus subtilis

YOU Qing，XU Wei*
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

To express laccase cotA gene from Bacillus subtilis in Escherichia coli expression system，cotA gene was cloned from Bacillus subtilis QM11 genome DNA by PCR.Plasmid pET22b containing cotA gene was constructed and transferred into competent Escherichia coli BL21（DE3）and the expression of recombinant protein was proved by SDS-PAGE.The gene cotA contained 1542 nucleotides，comprising one open reading frame encoding a polypeptide of 513 amino acids with 58 ku of relative molecular weight and predicted pI value of 5.91 and there was no signal peptide in cotA.The secondary structure of cotA was mainly β-sheet and random coil，β-sheet was 26.71%and random coil was 52.05%.There were twelve-site mutations between the nucleotide sequence from Bacillus subtilis QM11 and cotA（NCBI GenBank：GQ184294.1）from Bacillus subtilis，which could result in four amino acid substitution.The molecular weight of cotA gene protein was estimated to be 54 ku by SDS-PAGE.

Bacillus subtilis；laccase；gene cloning；sequence analysis；construction of expression vector；induced expression

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0225-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.038

2015－08－19

由慶（1990-），男，在讀碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)與發(fā)酵工程，E-mail：youq_will@126.com。

徐偉（1963-），女，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)與發(fā)酵工程，E-mail：xuw@hrbcu.edu.cn。

哈爾濱商業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（JYSCX2014-333HSD）。