楊 陽(yáng), 胡 翔

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酸性紅B高效降解耐鹽菌株BY-2的分離鑒定及降解特性研究

楊 陽(yáng), 胡 翔

(北京化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 北京 100029)

從已運(yùn)行一年的三相內(nèi)循環(huán)好氧生物流化床系統(tǒng)中分離篩選出一株降解酸性紅B的高效耐鹽菌株BY-2，通過對(duì)菌株的理化形態(tài)特征及16s rRNA序列分析，初步確定菌株BY-2為.屬?？疾炝顺跏紁H、鹽度、染料濃度以及接種量等條件對(duì)酸性紅B降解與菌體生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：初始pH為7，鹽濃度為50 g×L-1，酸性紅B初始濃度為500 mg×L-1，接種量2%，反應(yīng)18 h時(shí)，酸性紅B的降解率可達(dá)90% 以上。降解中間產(chǎn)物的紫外-可見光光譜和GC-MS分析說明菌株BY-2對(duì)酸性紅B有良好的降解作用，菌株BY-2在實(shí)際染料廢水處理中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

偶氮染料；酸性紅B；脫色；假單胞菌屬

1 引 言

人造染料的使用有數(shù)千年的歷史，而人工合成染色劑的使用始于1856年[1]。如今染料家族己經(jīng)有上千種染料成員，其應(yīng)用過程中產(chǎn)生的印染廢水也被排放入江河湖海，污染水體，成為頑固的污染物質(zhì)，偶氮染料廢水便是其中主要的部分。

酸性紅B(Acid Red B，ARB)，又稱酸性紅14，是一種帶藍(lán)光的酸性偶氮染料紅，主要用于絲綢紡織品染色，也常用于紙張、文具、墨水、木材的著色。結(jié)構(gòu)圖如圖1所示，其結(jié)構(gòu)帶有一個(gè)發(fā)色基團(tuán)偶氮鍵-N=N-，以及助色基團(tuán)萘基上連接的-OH以及-SO3，助色基團(tuán)增加染料水溶性，也增加其對(duì)纖維組織的黏附力[2]。該染料有良好的水溶性，因此少量進(jìn)入水體時(shí)就有較大的色度，干擾了水體的透光率，影響生物的代謝過程，使水體中生態(tài)多樣性下降[3]；其偶氮鍵斷裂可能生成芳香胺類化合物，有很強(qiáng)的致癌作用，因此酸性紅B作為偶氮染料的一種對(duì)其降解和脫色的研究備受研究者重視。

圖1 酸性紅 B 結(jié)構(gòu)式

目前，許多研究者致力于運(yùn)用高級(jí)氧化法、電化學(xué)法、吸附法、超聲波法等理化方法降解偶氮染料廢水[4~7]，其中Fe-C微電解[8]和UV-Fenton氧化處理[9]均取得較好效果。但由于其普遍運(yùn)行費(fèi)用高，操作復(fù)雜，容易產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)，影響了其廣泛使用及工業(yè)化；生物法由于其具有運(yùn)行費(fèi)用低、高效、一般不具有二次污染等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。目前對(duì)于酸性紅B的生物降解及脫色主要為厭氧法[10~12]，但厭氧菌增殖緩慢，啟動(dòng)周期長(zhǎng)。本研究中菌種從三相好氧生物流化床中分離篩選得出，該體系運(yùn)行穩(wěn)定，啟動(dòng)迅速，操作簡(jiǎn)單，從該系統(tǒng)中篩選得到的兼性厭氧耐鹽菌種BY-2對(duì)降解酸性紅B有高效降解作用，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)研究其降解特性，考察該菌種處理酸性紅B廢水的應(yīng)用潛力。

2 材料與方法

2.1 菌體的來源

本文中菌體(簡(jiǎn)稱FAS)取自北京化工大學(xué)水污染控制實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行一年的三相好氧生物流化床系統(tǒng)，一年中此系統(tǒng)用于酸性紅B模擬廢水的降解。

2.2 主要儀器及試劑

2.2.1 主要儀器

紫外分光光度儀UV-2012C/PC/PCS，DYY-6C型電泳儀，TC-733凝膠成像系統(tǒng)，TC-5000梯度PCR儀，H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)，SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，YT-CJ-1NB型超凈臺(tái)，MPR-312D(CN)-C顯微鏡。

2.2.2 試劑

酸性紅B(100%)購(gòu)自前門油漆化工原料公司；Biomed細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒；LB液體培養(yǎng)基；LB固體培養(yǎng)基。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 酸性紅B耐鹽降解菌株的分離篩選

取5 mL反應(yīng)器內(nèi)液體接入含有50 mg×L-1ARB的已滅菌200 mL LB液體培養(yǎng)基中，放入生化培養(yǎng)箱中30℃、180 r×min-1震蕩培養(yǎng)[13,14]，同時(shí)設(shè)置未接入菌液空白組；約48 h后觀察接入菌液培養(yǎng)基褪色，且三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基明顯渾濁，后吸取1 mL菌液接入新鮮LB液體培養(yǎng)基中(含100 mg×L-1ARB)，馴化轉(zhuǎn)接后，取100mL菌液稀釋106~107倍，用接種環(huán)沾取稀釋液在含有100 mg×L-1ARB的LB固體平板培養(yǎng)基中劃線分離，在平板上選擇形態(tài)不同的單菌落，重新接入含有100 mg×L-1ARB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，直至獲得形態(tài)單一的ARB高效降解菌種，命名為BY-2。

2.3.2 菌株BY-2的基因組提取、PCR擴(kuò)增及鑒定

菌株BY-2的基因組提?。喝? mL菌液，高速離心后用Biomed細(xì)菌基因組DNA快速提取盒提取。PCR擴(kuò)增：選取16SrDNA 基因序列的擴(kuò)增通用引物27f/1492r(正向引物 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，反向引物5’ -GGTACCTTGTTACGACTT-3’)，后續(xù)PCR產(chǎn)物的純化以及測(cè)序工作由北京博邁德生物科技公司完成。測(cè)序結(jié)果通過GenBank中的Blast搜索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列的同源性比較分析，選取代表性菌株用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3.3 菌株BY-2的降解特性研究

(1) 初始pH對(duì)ARB脫色及菌體生長(zhǎng)的影響：將初始培養(yǎng)基分別用1 mol×L-1NaOH或HCl調(diào)整至pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。滅菌后加入無菌ARB，使ARB濃度為100 mg×L-1，BY-2菌液接種量為2%，放入生化培養(yǎng)箱中30℃、180 r×min-1震蕩培養(yǎng)。

(2) 鹽度對(duì)ARB脫色及菌體生長(zhǎng)的影響：分別配制鹽度為10，20，30，40，50 g×L-1的液體培養(yǎng)基，調(diào)整初始pH為7，其余條件同前，震蕩培養(yǎng)。

(3) 染料濃度對(duì)ARB脫色及菌體生長(zhǎng)的影響：調(diào)整ARB濃度分別為50、100、200、300、400 和 500 mg×L-1，其余條件不變，放入生化培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)。

(4) 接種量對(duì)ARB脫色及菌體生長(zhǎng)的影響：BY-2菌液接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%和12%，其余條件不變，考察脫色效果。

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，并設(shè)空白對(duì)照組。

2.3.4 染料降解分析及測(cè)定方法

染料濃度的測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)測(cè)量515 nm(最大特征吸收峰)處的吸光度。

菌體濃度的測(cè)定：用紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處的OD值。

菌株BY-2形態(tài)掃描：由中科院微生物所的掃描電鏡進(jìn)行掃描，觀察其形態(tài)，掃描倍數(shù)10000倍。降解出水的紫外掃描：將篩選出菌株用于ARB模擬廢水降解，紫外掃描降解前后溶液變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 ARB高效脫色菌株的分離篩選及鑒定

經(jīng)多次馴化、劃線分離后，獲得多株對(duì)ARB有一定脫色能力的菌株，選取其中效果最好的一株，命名為BY-2。因與之進(jìn)行對(duì)照的空白組ARB未有明顯脫色現(xiàn)象，因此推測(cè)脫色效果由該菌株生物降解引起。隨后對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。

菌株BY-2在固體培養(yǎng)基上呈圓形，菌落較小、邊緣整齊，表面光滑，菌體呈乳白色，較易挑起革蘭氏染色結(jié)果顯示為革蘭氏陰性菌。由圖2所示，菌株BY-2為桿菌，長(zhǎng)度為1~3mm。

圖2 菌株 BY-2 電鏡掃描圖(10000 倍)

通過PCR擴(kuò)增后，獲得長(zhǎng)度為1421nt的BY-2 16s rRNA的基因片段，將該序列輸入NCBI的NR數(shù)據(jù)庫(kù)中，點(diǎn)擊Blast進(jìn)行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與NBRC 101713的16s rRNA基因序列高度同源，相似度達(dá)到99%，選取與其相似性高的9株菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，表明該菌株屬于假單胞菌屬()

圖3 菌株 BY-2 的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 菌株BY-2對(duì)ARB的降解特性

3.2.1 初始pH對(duì)ARB脫色及菌體生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基中初始pH對(duì)ARB脫色率和微生物生物量的影響如圖4所示，初始ARB濃度為100 mg×L-1，接種量為2%，恒溫振蕩12 h后，pH在5.0~8.0時(shí)，ARB脫色率為65%以上，pH為7時(shí)脫色率最高，達(dá)到80% 以上，生物量實(shí)驗(yàn)結(jié)果與脫色率結(jié)果基本一致。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，pH的變化對(duì)該菌種影響較大，在中性條件下生長(zhǎng)情況與脫色效果較好。

圖4 不同初始 pH 在 12 h 對(duì) ARB 脫色和菌株 BY-2 生長(zhǎng)的影響